Chromatografia

Chromatografia to metoda chemicznej analizy instrumentalnej, w której dokonuje się podziału substancji (w przeciwprądzie) między fazę nieruchomą (bibuła filtracyjna, cienka warstwa adsorbentu naniesiona na płytkę, wypełnienie kolumny) i fazę ruchomą, stanowiącą roztwór ciekły (chromatografia cieczowa) lub gazowy (chromatografia gazowa).

W tym celu wykorzystywana jest:
- różnica w zdolności adsorpcyjnej fazy stacjonarnej względem różnych składników znajdujących się w fazie ruchomej (chromatografia adsorpcyjna);
- różnica wielkości współczynnika podziału składników rozdzielanych między cieczą umieszczoną na nośniku (w fazie stacjonarnej), a fazą ruchomą (chromatografia podziałowa);
- różnica wielkości cząsteczek separowanych składników (chromatografia sitowa);
- zatrzymywanie jonów na podłożu jonitowym (chromatografia jonowymienna).

Stopień rozdziału można zwiększyć dobierając zarówno odpowiedni rozpuszczalnik, jak i substancję tworzącą fazę stacjonarną. Obraz analizy chromatograficznej otrzymany bezpośrednio w fazie stacjonarnej (np. barwne plamy w chromatografii bibułowej pochodzące od poszczególnych składników) lub wykres przedstawiający wyniki analizy w postaci pików odpowiadających rozdzielanym składnikom nosi nazwę chromatogramu.

Chromatografia może być stosowana do badań jakościowych, ilościowych i dla celów preparatywnych. Dla poszczególnych substancji, stosunek czasu spędzonego w obszarze fazy ruchomej i stacjonarnej jest równy stosunkowi ich stężenia w tych obszarach, i określany jest jako stała podziału (w przypadku fazy stałej często stosowany jest termin izoterma adsorpcji).

Badana mieszanina jest wprowadzona do układu w postaci wąskiej strefy (punkt wyjściowy), po czym substancje są transportowane z różną szybkością zgodnie z kierunkiem przepływu fazy ruchomej. Siłą napędową migrującej substancji jest poruszająca się faza ruchoma, a siłą przytrzymującą jest powinowactwo substancji do fazy stacjonarnej; kombinacja obu tych sił, kontrolowana przez analityka, prowadzi do rozdzielenia składników mieszaniny na poszczególne substancje.

Chromatografia jest jedną z kilku technik separacyjnych określanych jako migracja różnicująca z wąskiego początkowego pasma. Elektroforeza jest inną techniką z tej grupy. W tym przypadku siłą napędową jest pole elektryczne, które wywiera odmienne siły na różne ładunki jonowe poszczególnych substancji. Siłą przytrzymującą jest lepkość nie poruszającego się rozpuszczalnika. Kombinacja tych sił powoduje ruch jonów charakterystyczny dla każdej substancji rozpuszczonej.

Elementy elektroforezy kapilarnej

Chromatografia znajduje liczne zastosowania w dziedzinie biologii i chemii. Jest szeroko stosowana w badaniach biochemicznych jako metoda służąca do separacji i identyfikacji związków chemicznych pochodzenia biologicznego. W przemyśle naftowym technika ta umożliwia analizę skomplikowanych mieszanin węglowodorowych. Jako metoda separacyjna, chromatografia ma liczne zalety w porównaniu do starszych technik rozdzielania np. krystalizacji, ekstrakcji za pomocą rozpuszczalnika i destylacji. Pozwala na separację wszystkich składników chemicznych mieszanin wieloskładnikowych bez potrzeby posiadania rozległej wiedzy o liczbie lub względnej ilości obecnych substancji oraz ich rodzaju. Jest uniwersalna ponieważ umożliwia rozdzielanie cząsteczek o różnych rozmiarach, począwszy od wirusów zbudowanych z milionów atomów do najmniejszych ze wszystkich cząsteczek - cząsteczek wodoru, zawierających tylko dwa atomy; co więcej, może być zastosowana przy małych lub dużych ilościach próbek. Dzięki niektórym rodzajom chromatografii można wykrywać substancje obecne na poziomie piktogramów czyniąc metodę znakomitą techniką do oznaczania śladowych ilości, szeroko stosowaną do wykrywania chlorowanych pestycydów w materiałach biologicznych i środowisku, w sądownictwie oraz przy wykrywaniu narkotyków w przypadku nadużyć i w terapeutyce.

Jej możliwości rozdzielcze są nieporównywalne do innych metod separacyjnych.

Chromatografia kolumnowa

W chromatografii kolumnowej podział składników mieszaniny pomiędzy stały adsorbent i rozpuszczalnik pozwala na jej rozdzielenie i wyodrębnienie poszczególnych składników. Adsorbentami najczęściej używanymi, są tlenek glinowy (kwaśny, zasadowy lub obojętny) i żel krzemionkowy o odpowiedniej aktywności, które umieszczone są w pionowej, szklanej rurze. Kolumnę (rurę) dobiera się tak, aby była ona napełniona mniej więcej do połowy wysokości. Im większy jest stosunek wysokości kolumny do jej średnicy, tym lepszy osiąga się rozdział. Zwykle jednak stosunek ten wynosi od 20:1 do 10:1, ponieważ zbyt wysoka warstwa adsorbentu stawiałaby przepływającemu roztworowi zbyt duży opór hydrauliczny. Na ogół do chromatografii kolumnowej używa się od 20 do 50 gramów adsorbentu na każdy gram rozdzielanej mieszaniny. Zazwyczaj używa się kolumn zaopatrzonych w kran, który musi być szczelny (kranu nie należy smarować, aby uniknąć zanieczyszczaniu rozdzielanych substancji smarem).

Adsorbent w kolumnie umieszcza się na tamponie z waty, zwykle pokrytym warstwę czystego piasku. Kolumna musi być tak napełniona, aby nie pozostały w niej pęcherzyki powietrza. Nie zaleca się napełniania kolumny suchym adsorbentem, gdyż nie uzyskuje się wtedy równego ułożenia napełnienia i rozdział jest mało precyzyjny.

Prawidłowe napełnienie kolumny można przeprowadzić w następujący sposób: do kolumny nalewa się rozpuszczalnik (około 2/3 jej wysokości) i umieszcza się w jej dolnym końcu watę. Po usunięciu pęcherzyków powietrza wsypuje się cienkim strumieniem adsorbent bezpośrednio do rozpuszczalnika. Inna metoda napełnienia kolumny polega na wlaniu papki adsorbentu z rozpuszczalnikiem. Podczas dodawania adsorbentu reguluje się wypływ rozpuszczalnika u dołu kolumny, tak jednak, aby adsorbent przez cały czas był przykryty warstwą rozpuszczalnika. Zebrany rozpuszczalnik zawraca się na szczyt kolumny. Po osadzeniu się adsorbentu, ostukuje się kawałkiem węża gumowego na końcu bagietki aż adsorbent przestanie osiadać. Przez cały czas należy zwracać uwagę na to, aby warstwa adsorbentu była przykryta warstwą rozpuszczalnika. Górną powierzchnię adsorbentu należy przykryć piaskiem i małym krążkiem bibuły, co zapobiega unoszeniu adsorbentu podczas wprowadzania roztworu na kolumnę. Możliwość rozdziału na kolumnie sprawdza się uprzednio metodą chromatografii cienkowarstwowej. Podobnie można dobrać odpowiedni adsorbent i rozpuszczalnik lub układ rozpuszczalników.

Ustalono kilka ogólnych reguł, którymi można się kierować przy doborze rozpuszczalnika:
- Wzrost polarności rozpuszczalnika zwiększa jego zdolność do wymywania substancji z polarnego adsorbentu.
- Im bardziej polarne substancje poddaje się rozdziałowi, tym bardziej polarny rozpuszczalnik i tym mniej aktywny adsorbent należy stosować
- Jeżeli do rozdzielania poszczególnych składników mieszaniny trzeba użyć rozpuszczalników o różnej polarności, to dodaje się drugi rozpuszczalnik (bardziej polarny od pierwszego, ponieważ zbyt nagłe podwyższenie polarności mieszaniny może spowodować zlewanie się rozwiniętych uprzednio pasm.

Do przygotowanej kolumny wprowadza się rozwór rozdzielanych substancji w możliwie małej ilości rozpuszczalnika. Wskazane jest użycie tego samego rozpuszczalnika, którym napełniono kolumnę. Jeżeli substancje rozpuszczają się słabo, można wprowadzić je na kolumnę w postaci zawiesiny. Po wlaniu roztworu do kolumny otwiera się lekko kran i czeka aż poziom roztworu obniży się do poziomu adsorbentu. Czynność tę należy wykonać możliwie powoli i dokładnie. Następnie wlewa się do kolumny rozpuszczalnik i rozpoczyna rozwijanie chromatogramu. Szybkość wypływu cieczy z kolumny powinna by początkowo mała (kropla na sekundę), a następnie można ją zwiększyć do kilku kropel na sekundę. W tym czasie uwidaczniają się oddzielne pasma składników. Przemywanie kolumny rozpuszczalnikiem prowadzi się dalej. W ten sposób roztwory poszczególnych substancji spływają do odbieralników. Jeśli substancje nie są zabarwione, to ich rozdział można śledzić obserwując kolumnę w świetle nadfioletowym, lub (częściej) kontrolując skład frakcji za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. Frakcje o identycznym składzie łączy się ze sobą. Frakcje zawierające kilka składników (tzw. międzyfrakcje) poddaje się ponownemu rozdzieleniu (na nowej kolumnie) lub, jeśli jest ich mało i składniki nie są zbyt cenne, odrzuca. Z roztworu substancje wydziela się przez odparowanie rozpuszczalnika na wyparce obrotowej. Pełne oczyszczenie wydzielonych substancji wymaga jeszcze zwykle krystalizacji lub destylacji.

Chromatografia cienkowarstwowa

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC—ang. thin layer chromatography) jest specjalną odmianą chromatografii, w której fazą stałą jest cienka (0,25 - 2,0mm) warstwa adsorbentu, np. tlenku glinowego lub żelu krzemionkowego, naniesiona na płytkę szklaną lub inny materiał (folia aluminiowa, folia z tworzywa sztucznego). Pozwala ona na rozdział bardzo małych ilości substancji (5-100g) w celach analitycznych, lub nieco większych (do 2g) w celach preparatywnych.

Stosuje się ją do celów diagnostycznych (badanie składu mieszanin), do rozdzielania preparatywnego oraz do oznaczeń ilościowych.

Jeżeli doświadczenie przeprowadza się w stałych warunkach) to wartość ta w danym układzie chromatograficznym jest dla danej substancji stała i charakterystyczna.

Jako komorę do rozwijania płytek można stosować słoik szklany lub zlewkę przykrytą szkiełkiem zegarkowym.

Roztwory badanych substancji nanosi się na płytkę kapilarami, w odległości 1—2cm od brzegu lub od siebie, starając się, aby naniesione plamki miały jak najmniejsze średnice. Tak przygotowaną płytkę roztworów naniesionymi plamkami substancji wzorcowych i roztworów badanych wstawia ostrożnie się do komory, na której dnie znajduje się warstewka około 0,5cm rozpuszczalnika i przykrywa komorę. Gdy rozpuszczalnik osiągnie odpowiednią wysokość (6—10cm od punktu startu) wyjmuje się płytkę z komory, oznacza czoło rozpuszczalnika i suszy.
W celu wykrycia wszystkich związków zawartych w mieszaninie, rozwiniętą i wysuszoną płytkę poddaje się działaniu odczynnika wywołującego (tj. związku, który reaguje ze wszystkimi możliwymi składnikami mieszaniny, np. pary jodu, stężony kwas siarkowy) lub ogląda w świetle UV. Prawie wszystkie związki organiczne, poza węglowodorami nasyconymi i chlorowcopochodnymi tworzą z parami jodu barwne kompleksy o charakterystycznych barwach. Wywoływanie parami jodu przeprowadza się w szczelnych komorach z kilkoma kryształami jodu wewnątrz. Po wywołaniu płytkę należy opisać I obliczyć wartości RF dla poszczególnych plam.

Chromatografia bibułowa

Chromatografia bibułowa jest stosunkowo prostą metodą stosowaną na przykład w rozdzieleniu barwników chloroplastów. Ekstrakt barwników, uzyskiwany przez roztarcie liści wybranej rośliny z odpowiednim rozpuszczalnikiem stanowi mieszaninę, którą należy rozdzielić. Bibuła chromatograficzna to faza nieruchoma, a mieszanina rozpuszczalników to faza ruchoma. Na bibułę nanosi się przesączony ekstrakt barwników i całość suszy. Do szklanego naczynia (komory chromatograficznej) wlewa się mieszaninę rozpuszczalników. Po wysyceniu wnętrza komory oparami rozpuszczalników umocowuje się w niej pasek bibuły. Mieszanina wsiąka w bibułę i unosi się ku górze, a z nią przemieszczają się barwniki. Szybkość przemieszczania się barwników jest różna. Barwnik najłatwiej rozpuszczalny przesuwa się najszybciej co prowadzi do rozdzielenia wszystkich barwników na pasku bibuły.

Chromatografia gazowa

Chromatografia gazowa to analityczna technika chromatograficzna, w której fazą nośną jest gaz (najczęściej hel, coraz rzadziej wodór). Technika ta umożliwia procentowe ustalenie składu mieszanin związków chemicznych, w których występuje ich nawet kilkaset. Nie umożliwia natomiast bezpośredniej identyfikacji struktury chemicznej związków, za wyjątkiem aparatów z detektorem masowym. Chromatografia gazowa jest najczęściej stosowaną metodą do szybkiej analizy złożonych mieszanin związków chemicznych oraz oceny czystości tych związków, zarówno w przemyśle jak i w rozmaitych laboratoriach.

Chromatografię gazową stosuje się m.in. w:
- przemyśle petrochemicznym - np. do oceny składu chemicznego produkowanej benzyny
- ochronie środowiska - do oceny stopnia zanieczyszczenia, gleby, powietrza i wody.
- kryminalistyce - np. do analizy źródła pochodzenia narkotyków na podstawie składu zawartych w nich zanieczyszczeń
- kontroli antydopingowej - gdzie aparaty GC-MS (Gas chromatography - mass spectrometry) stanowią podstawową metodę wykrywania niedozwolonych substancji w krwi, pocie, moczu i ekstrakcie z włosów sportowców.

Chromatografia cieczowa

Chromatografia cieczowa rodzaj chemicznej techniki analitycznej - chromatografia, w której eluentem jest ciecz, zwykle jakiś rozpuszczalnik. Istotą każdej chromatografii cieczowej jest rozdział analizowanej mieszaniny na poszczególne związki chemiczne poprzez przepuszczanie roztworu tej mieszaniny przez stałe lub żelowe złoża, co w pewnym sensie przypomina filtrację. Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami tworzącymi mieszanię a złożem jedne z nich przechodzą przez złoże szybciej a i inne wolniej.

Istnieje bardzo wiele rodzajów chromatografii cieczowej, które można podzielić na trzy ogólne rodzaje:
- chromatografia cienkowarstwowa - w której złoże (zwykle żel krzemionkowy) jest nałożone na płytkę szklaną lub metalową w formie, cienkiej, sprasowanej formy. Rozdział następuje poprzez powolne wnikanie roztworu w złoże
- chromatografia kolumnowa - w które złoże umieszcza się w kolumnie, po czym przez kolumnę przepuszcza się roztwór analizowanej mieszaniny - jej szczególnym przypadkiem jest HPLC
- elektroforeza - która w zasadzie jest formą chromatografii cienkowarstwowej, w której jednak najpierw nasącza się złoże mieszaniną, a rozdział następuje na skutek działania pola elektrycznego.