Inżynieria genetyczna, jako ingerencja w strukturę genową komórek lub organizmów od początku swojego istnienia budziła wiele kontrowersji, ponieważ modyfikacja funkcji określonego odcinka DNA jest rzeczą niezwykłą, której skutki mogą okazać się największym odkryciem i przełomem w dziedzinie genetyki i medycyny, ale mogą również na przestrzeni wielu lat doprowadzić do zagłady człowieka.
Termin inżynieria genetyczny należy kojarzyć z licznymi technikami modyfikowania lub manipulowania organizmami poprzez procesy dziedziczenia i rozmnażania. Obejmuje on zarówno sztuczną selekcję, jak i wszystkie typy interwencji w naturalne procesy biologiczne za pomocą technik biomedycznych, np. sztuczne unasiennianie, inseminację, zapłodnienie in vitro, klonowanie czy manipulowanie genami. DNA jako nośnik informacji genetycznej ma kluczowe znaczenie w sterowaniu biosyntezą białka. Najwięcej metod technologii rekombinowanego DNA dotyczy wprowadzenia obcych genów do plazmidów szczepów bakterii powszechnie stosowanych w badaniach laboratoryjnych. Plazmidy są małymi, kolistymi cząsteczkami DNA. Mimo że nie stanowią części chromosomu, mogą sterować syntezą miałka i są powielana i przenoszone na potomstwo bakterii. W ten sposób wprowadzając obce DNA do bakterii naukowcy są w stanie otrzymać nieograniczoną liczbę kopii zmodyfikowanego genu. Dzięki technikom rekombinacji DNA stworzono bakterie, które są zdolne do syntezy ludzkiej insuliny, hormonu wzrostu, szczepionki i wiele innych. Istnieje jednak niebezpieczeństwo, że osiągnięcia te mogą zostać źle wykorzystane i w ich wyniku mogą powstać drobnoustroje o niekorzystnych cechach np. odporność na antybiotyki, produkujące toksyny lub wywołujące choroby.
A oto kilka technik wykorzystywanych w tej dziedzinie nauki:
Elektroforeza agarozowa DNA
Elektroforeza DNA w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym jest standardową metodą pozwalającą rozdzielić, zidentyfikować lub oczyścić fragmenty DNA. Do zalet tej metody należy zaliczyć jej prostotę a także możliwość bezpośredniej lokalizacji fragmentów DNA w żelu przy pomocy barwnika interkalującego - bromku etydyny.
Elektroforeza białek
Metoda rozdziału elektroforetycznego białek pozwala na rozdzielenie poszczególnych frakcji białkowych o masach cząsteczkowych w zakresie ok. 10 - 200 kDa (kilodaltonów), na podstawie zróżnicowanej ruchliwości elektroforetycznej w polu elektrycznym. Ruchliwość ta jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu masy cząsteczkowej.
Selekcjonowanie DNA
Technika odczytywania kolejności zasad tworzących cząsteczkę DNA. Obecnie najczęściej używaną metodą jest metoda Sangera, oparta o syntezę DNA przez polimerazę DNA in vitro. Do reakcji dodaje się niewielką ilość trifosforanów dideoksynukleotydów (ddNTP), które są wbudowywane w DNA, ale ich dołączenie uniemożliwia dalsze wydłużanie nici. W ten sposób otrzymuje się fragmenty DNA o różnej długości zakończone specyficznym nukleotydem. Produkty reakcji rozdziela się elektroforetycznie, co powoduję ich segregację pod względem wielkości.
Zasada sekwencjonowania DNA metodą Sangera:
A. – przykładowa sekwencja DNA
B. – przyłączenie startowego oligonukleotydu do nici matrycowej i kierunek syntezy DNA
C. - produkty syntezy DNA, zakończone fluorescencyjnie znakowanymi dideoksynukleotydami (kolorowe litery)
D. – Chromatogram rodziału fragmentów w elektroforezie kapilarnej.
Obecnie metoda odczytu została zautomatyzowana dzięki wykorzystaniu znakowanych fluorescencyjnie tirfosforanów dideoksynukleotydów i pozwala na odczyt 300-1000 par zasad z jednej kapilary/linii na żelu. Najczęściej używanymi maszynami służącymi do odczytu reakcji sekwencjonowania są produkty firmy ABI.
PCR
Polymerase chain reaction łańcuchowa reakcja polimerazy to reakcja służąca do amplifikacji (namnożenia) wybranego fragmentu DNA in vitro. Jedną z odmian tej techniki jest tzw. in situ PCR, pozwalający przeprowadzić reakcję PCR wewnątrz komórki.
Reakcja, która jest prowadzona w termocyklerach, wymaga: termostabilnej polimerazy DNA (np. polimerazy Taq), wolnych trójfosforanów nukleotydów, jonów Mg2+ oraz primerów.
Primery (startery) są krótkimi (zazwyczaj 18-24 nukleotydów długości), jednoniciowymi fragmentami DNA, które łączą się z komplementarnym fragmentem DNA i umożliwiają polimerazie DNA rozpoczęcie reakcji.
Pierwszym etapem reakcji jest denaturacja podwójnej helisy DNA, która zachodzi w temperaturze ok. 95˚C. Następnie temperatura jest obniżana do ok. 50˚C, co umożliwia połączenie się primerów z komplementarnymi sekwencjami. W końcu, temperatura jest podnoszona do ok. 72˚C i rozpoczyna się reakcja polimeryzacji, w wyniku której powielany jest fragment zawarty pomiędzy dwoma primerami. Ta sekwencja cykli jest powtarzana wiele razy, w zależności od ilości materiału, który chce się uzyskać.
Wykorzystanie termostabilnej polimerazy zapobiega nieodwracalnemu zniszczeniu enzymu podczas etapu ogrzewania próbki do temperatury denaturacji podwójnej helisy DNA.
Reakcja PCR doczekał się wielu odmian m.in. Real-Time PCR, Reverse-transcription PCR, Error-prone PCR.
Jest powszechnie wykorzystywana do np. amplifikacji genów, określania obecności i orientacji wstawionego do wektora fragmentu. Znalazła zastosowanie w dziedzinach takich jak biologia molekularna, kryminalistyka, diagnostyka medyczna.
Klonowanie
Technika klonowania polega na przeszczepieniu jądra dowolnej komórki organizmu do komórki jajowej innego organizmu tego samego gatunku. Umożliwia to poza seksualne mnożenie osobników gatunku ludzkiego o identycznej informacji genetycznej, czego konsekwencją stać się może seryjna produkcja dowolnie planowanych sobowtórów, czyli osobników o identycznych uzdolnieniach fizycznych i duchowych. Jeżeli zatem będzie się dokonywać tego zabiegu na substancji genetycznej wybitnych jednostek, to ile razy uda się ten zabieg szczęśliwie przeprowadzić, otrzyma się w wyniku tylu takimi samymi właściwościami obdarzonych osobników. Technicznie możliwe stało się klonowanie nowych istot ludzkich w taki sam sposób, w jaki powstała owca Dolly. Techniki inżynierii genetycznej osiągnęły obecnie taki stopień zaawansowania, że każda z setek milionów komórek ludzkiego ciała może być wykorzystana do stworzenia nowej istoty ludzkiej. Jednakże, jak dowodzi tego przykład bliźniąt jednojajowych, klon człowieka nie byłby jego dokładną repliką. Byłaby to osoba o identycznych genach, różniąca się jednak charakterem czy inteligencją od pierwowzoru