Inżynieria dynamicznie rozwijającą się nauką

Temat : Inżynieria genetyczna dynamicznie rozwijającą się nauką.

Inżynieria genetyczna stwarza możliwości konstruowania organizmów o zupełnie nowych właściwościach genetycznych, które na drodze naturalnych procesów mutacji i rekombinacji nigdy w naturze nie powstały. Wytworzenie w przyszłości komórek, czy nawet całych organizmów posiadających połączenia genów różnych organizmów stwarzać będzie zupełnie nowe możliwości badawcze, których zakres i znaczenie trudno jest w tej chwili przewidzieć.
Jednym z osiągnięć inżynierii genetycznej jest możliwość modyfikacji genetycznej roślin na różne sposoby i w różnych celach. Naukowcy na całym świecie pracują nad usprawnieniem i udoskonaleniem metod produkcji żywności oraz wydłużeniem jej czasu przydatności do spożycia. Dzieje się to poprzez wprowadzenie określonych zmian na poziomie DNA w genach komórki. Możliwe jest także uzupełnienie cech danej rośliny o cechę dodatkową jak na przykład zdolność do wytwarzania substancji, której nie akceptują szkodniki. Można również osłabić dane cechy. Znany jest przypadek wyhodowania w Kalifornii pomidorów, które wyposażono w gen, dzięki któremu nie miękły tak szybko i dłużej zachowywały twardość. Obecnie modyfikacje genetyczne są używane głównie w celu uzyskania możliwości uprawy roślin w niekorzystnych warunkach np. na pustyni lub w mroźnym klimacie. Nadzieje wiązane z tymi trwającymi pracami są bardzo duże. Oczekuje się, że ich wyniki pomogą w zaspokojeniu ogromnego deficytu żywności w skali świata. Należy jednak pamiętać o niebezpieczeństwach płynących z takiego zastosowania genetyki jak choćby możliwość uodpornienia się zwierząt i człowieka na antybiotyki, z powodu tzw. markera, czyli odpornego na antybiotyki genu wprowadzanego do organizmu rośliny w celu sprawdzenia osiągniętego przez nią stopnia modyfikacji.
Geny pochodzenia zwierzęcego czy roślinnego mogą w komórkach bakterii lub innych organizmów podlegać ekspresji i produkować w znacznych ilościach różnego rodzaju białka enzymatyczne i hormony, co stwarza możliwości produkcji i jest obecnie wykorzystywane przez liczne firmy w przemyśle chemicznym lub farmaceutycznym. Wykorzystuje się ją obecnie w medycynie : zarówno w diagnostyce jak i profilaktyce czy nawet terapii. Przemysł farmaceutyczny skorzystał dzięki stworzeniu szeregu leków dzięki technikom rekombinowanego DNA. do produkcji niektórych leków, np.: ludzkiej insuliny stosowanej w leczeniu cukrzycy, hormonu wzrostu, czynnika krzepliwości krwi podawanego chorym na hemofilię czy antybiotyków. Udało się także uzyskać białko wchodzące w skład szczepionek przeciwko wirusowi HBV, który wywołuje ostre i przewlekłe zapalenie wątroby typu B i wiele innych substancji służących np.: do leczenia pewnych typów nowotworów. Inżynierię genetyczną wykorzystuje się do diagnozowania chorób na podstawie


identyfikacji zmian DNA. Te procedury mogą pokazać, kto w danej rodzinie, w
której występuje choroba o podłożu genetycznym, ma gen predysponujący do tego typu choroby, a kto nie. Osoby takie podlegają profilaktyce, która ma na celu zapobieganie wykształcenia się choroby. Nowoczesne metody leczenia niepłodności, zapłodnienie in vitro dają szansę tysiącom bezdzietnych małżeństw. Metody inżynierii genetycznej znalazły również zastosowanie w medycynie sądowej. Jeśli na miejscu zbrodni znajdziemy krople krwi lub nabłonek za paznokciami ofiary możemy dowiedzieć się, analizując DNA, do jakiej osoby one należą. Metoda ta służy również do identyfikacji zwłok po wypadkach samochodowych, samolotowych czy działaniach wojennych, gdzie inne metody ze względu na zniekształcenie ciała mogą być nieskuteczne. Możliwe jest też badanie pokrewieństwa między osobami np.: stwierdzenie ojcostwa.


CIEKAWOSTKI

1) Muflon

Włoscy i polscy naukowcy we współpracy z badaczami z Roslin Institute Edynburgu sklonowali wymierający gatunek muflona europejskiego (Ovis orientalis musimon). Wykorzystali oni technikę wynalezioną przy klonowaniu słynnej owieczki Dolly.
Materiał genetyczny pochodził z komórek pęcherzyka jajnikowego samicy muflona. Komórki te pobrano od martwych zwierząt 18 do 24 godzin po śmierci. Wyizolowano DNA i wprowadzono go do dojrzałej komórki jajowej owcy domowej (Ovis aries). Tak zmodyfikowany zarodek wszczepiony został do macicy matki zastępczej, również owcy domowej. Po 155 dniach ciąży przyszła na świat samica muflona europejskiego.
Badania genetyczne potwierdziły, że DNA nowo narodzonego muflona pochodzi od dawcy materiału genetycznego i nie zawiera ani DNA komórki jajowej owcy domowej, ani DNA matki zastępczej.
Jest to pierwsza zakończona sukcesem próba klonowania, gdzie dawca materiału genetycznego i komórka jajowa biorcy należą do dwóch różnych, choć blisko spokrewnionych gatunków. DNA pochodziło ponadto od martwego zwierzęcia, możliwe jest zatem wyizolowanie pełnowartościowego DNA nawet od już nie żyjących osobników.

2) DNA gołym okiem!!!

Kilka podstawowych informacji powinno nam pomóc w zobaczeniu DNA uzyskanego własnymi rękami. Skoro DNA znajduje się w jądrze komórkowym każdej komórki, to trzeba najpierw je stamtąd wyciągnąć. Jeżeli zniszczymy kapsułkę, jaką jest otoczka komórkowa to odsłonimy i umożliwimy manipulacje makromolekuły DNA.
Materiał biologiczny, który posłuży nam jako źródło DNA musimy najpierw rozdrobnić. Im dokładniej to zrobimy tym więcej komórek oddzieli się od jednolitej struktury tkankowej a więc więcej komórek zostanie wystawione na działanie kolejnych etapów naszej ekstrakcji. Do rozdrobnienia możemy użyć na przykład; wyciskarki do czosnku, wszelkiego rodzaju maszynek do mielenia stosowanych w kuchni, bardzo dobry efekt daje stosowanie miksera czy sokowirówki, można użyć też piasku o bardzo drobnej strukturze. Ten ostatni można uzyskać przez przesiewanie i rozdział na podstawie szybkości opadania w wodzie. Pamiętać jednak należy, że powinniśmy go przez użyciem wyprażyć,
ze względu na przeogromną liczbę mikroorganizmów na jego powierzchni. W
przypadku mało uwilgoconego materiału dodajemy wodę. Po ukończonym rozdrabniania otrzymujemy papkę, którą możemy poddać kolejnym procesom. Inny sposób to rozdrabnianie w niezbyt małe kawałki i poddawanie takich kawałków działaniu buforu. Dopiero tutaj rozdrabnianie struktury materiału zostaje zakończone. Ma to na celu ograniczenie degradacji DNA.
Do niszczenia osłon komórkowych posłużą detergenty z łaciny. detergens, -ntis, czyli rozbijający od detergere, czyli ścierać, zerwać, rozbić. Związki takie stosujemy do różnego rodzaju środków czyszczących, gdyż wykazują one wysoką aktywność powierzchniową dzięki posiadaniu przynajmniej jednej grupy hydrofilowej i jednej hydrofobowej.
Cząsteczki detergentu takiego jak choćby mydło, posiadają w swej strukturze część hydrofilową, która w roztworze z woda zwraca się w jej kierunku i część hydrofobową zwróconą przeciwnym kierunku. Dzięki temu zawsze elementy hydrofobowe dożą z wielką siłą do siebie, jeśli znajdują się w roztworze wody. Jeżeli więc w tym samym roztworze, co detergent znajdują się inne substancje hydrofilne jak np. tłuszcze to fragmenty hydrofobowe detergentu będą z ogromna "determinacją" dożyły do kontaktu z nimi. Może to być tłuste zabrudzenie lub też tłuszcz na powierzchni żywej komórki. Otoczenie takiej grudki tłuszczu przez detergent powoduje powstawanie emulsyjnych struktur łatwo porywanych do roztworu. Błona komórkowa jest wybiórczo przepuszczalną błoną zbudowaną z cząsteczek fosfolipidów i białek. Fosfolipidy zaś to cząsteczki tłuszczów złożonych, stanowią bardzo ważny składnik błon biologicznych, budując dwu warstwową część lipidową. Jeżeli więc detergent napotka na strukturę komórkową to będzie porywał z niej wszystkie elementy tłuszczowe, przez co zdestabilizuje całość i doprowadzi do jej rozpadu. I o to nam chodzi. Detergent odgrywa jeszcze jedna funkcje obok rozrywania ścian komórkowych. Rozbija również duże białka ułatwiając degradacje. Dzieje się to znów dzięki zjawisku wkręcania się hydrofilowych części do struktur białka, które również mają fragmenty hydrofilowe i hydrofobowe. DNA nie występuje w komórce w formie wolnej, jest natomiast cały czas połączone z białkami stabilizującymi, które buduje między innymi wspólnie z DNA chromosomy. Rozbijając białka oczyszczamy w pewnym stopniu z nich nas interesujące makromolekuły, czyli DNA.
Dalsza część procesu polega na pozwoleniu by molekularna zawartość wypłynęła z komórek do zrobionego przez nas buforu. Pierwszy składnik tego buforu już znamy, jest to detergent. Możemy tu zastosować prawie każdy dostępny w domu środek myjący, płyn do naczyń, szampony do mycia włosów, ale im prostszy tym lepszy. Oznacza to, że powinien zawierać jak najmniej środków dodatkowych na przykład zapachowych czy barwiących. Mydło zawiera tych środków dużo, ale za to zastosowanie szarego mydła gwarantuje
obecność samego detergentu. Do około 10 ml, czyli jednej łyżki takiego
detergentu dodajemy, jakieś 5 g. sody oczyszczonej oraz ćwierć łyżeczki, czyli 1,5 g. soli kuchennej. Dopełniamy to do objętości 100 ml wodą, najlepiej destylowaną, by nie zawierała jonów wapnia i magnezu, czyli była miękka. Rozpuszczając sól i sodę należy mieszać ostrożnie by nie zapienić roztworu. Tak przygotowany roztwór bufory najlepiej schłodzić. Wkładamy go w tym celu do lodówki, natomiast podczas manipulacji nim przy doświadczeniu możemy trzymać go w łaźni z lodem, czyli po prostu szklankę z buforem wkładamy do większego pojemnika z lodem z zamrażarki. Zyskamy wtedy na powolniejszej degradacji naszego "cennego" DNA.
Zawartość soli w buforze wytwarza jony w postaci, których sól rozpuszcza się w wodzie. Dzięki dodatnim jonom DNA jest zobojętniane poprzez przyciąganie ich do ujemnych ładunków na powierzchni kwasu dezoksyrybonukleinowego. Zobojętnienie to umożliwia zbliżenie się do siebie fragmentów DNA. Regulując stężenie soli regulujemy wzajemne relacje zbliżania i oddalania od siebie kwasów nukleinowych.
Teraz poddajemy naszą organiczną papkę działaniu schłodzonego buforu. Stosunek powinien wynosić jak jedna część papki do dwóch części buforu. Najlepiej 5 ml papki i 10 ml oziębionego buforu. By działanie buforów na komórki było dokładne należy to teraz dokładnie i energicznie wymieszać przez jakieś 3 minuty. Jeśli wybraliśmy metodę niezbyt drobnych kawałków, wtedy możemy to wszystko włożyć do łaźni wodnej o temperaturze 55 - 60C na 10 - 12 minut pamiętając by nigdy nie przekraczać 15 gdyż spowoduje to rozpad DNA. Detergent rozkłada teraz cząsteczki lipidowe, które trzymają błony komórki razem. Dzięki temu DNA może przedostać się do roztworu. Detergent, łącznie z traktowaniem roztworu podwyższoną temperaturą, powoduje, że lipidy i białka, uwalniają nam "nagie" DNA. Teraz możemy szybko ochłodzić roztwór poprzez zanurzenie go w kąpieli wodnej z lodem na 5 minut.
W naszym roztworze powinno już zajść wypłukanie makromolekuł z komórek do buforu. Jednak jak widzimy mamy jedynie roztwór o konsystencji zupy, w którym pływają większe elementy organiczne. Trzeba je oddzielić najprościej jest, więc odfiltrowywanie za pomocą filtra do kawy i późniejsze ewentualne odlanie klarownego roztworu. Nalewając mieszaninę na filtr, unikamy wlewania tam piany. Proces filtrowania może trwać godzinę lub dłużej, więc można cały zestaw zostawić na ten czas w lodówce.
Najlepiej jednak było by gdyby możliwe było użycie jakiejś mikrowirówki domowej roboty. Obroty nie muszą być duże a czas to około 5 minut chodzi jedynie o oddzielenie grubych fragmentów tkanek. Jeżeli mamy już, co najmniej 5 ml klarownego roztworu, w którym mamy nadzieje jest DNA to możemy przystąpić do dalszej pracy.
Liczymy na to, że w roztworze znajduję się DNA jednak pewni możemy
być, że są w nim inne cząsteczki, których w cale nie chcemy. Teraz potrzebny
nam jest związek, którego nie używamy tradycyjnie w kuchni, czyli izopropanol. Również teraz należy pamiętać by był on bez dodatków zapachowych i barwnikowych, ma mieć też jak najwyższe stężenie. Czysty izopropanol kupić można w aptece jako środek odkażający lub w sklepach z elektroniką czy optyką gdyż jest środkiem czyszczącym. Stosując w tej procedurze alkohol należy schłodzić go do jak najniższej temperatury. Teraz należy około 10 ml izopropanolu ostrożnie umieścić na powierzchni roztworu, możemy to zrobić przelewając go bardzo powoli po ściance, ale najlepiej zrobić to słomką do napojów służącą jako pipeta. Powolne spuszczanie izopropanolu strużką po przechylonej ściance naczynia umożliwia warstwowe rozgraniczenie buforu od mniej gęstego izopropanolu, który będzie na powierzchni. DNA nie rozpuszcza się w alkoholu i jeśli poczekamy 2 - 3 minuty bez wstrząsania pojawia się w nim w postaci kłaczkowatej
Teraz możemy spróbować wyciągnąć DNA z roztworu, za pomocą cienkiej pałeczki czy patyczka czy drucika najlepiej z zakrzywioną końcówką. Bardzo delikatnie przeprowadzamy ją przez warstwę alkoholu aż do buforu, w której powinna być nieco zanurzona. Przesuwamy ją w górę i w dół jednocześnie powoli obracając. Jeśli nasze DNA nie jest zbyt zdegradowane to znajduję się tam długie odcinki DNA, które nawiną się na pałeczkę. Mniejsze niestety pozostaną w roztworze. Po jakiejś minucie możemy przenieść takie DNA pałeczką do czystego buforu bez detergentu i w ten sposób będziemy mieli możliwość oglądania pod światło cząsteczek DNA. Pomimo niedoskonałości umożliwia nam to oglądanie może nie czystego, ale jednak DNA. Zresztą część zanieczyszczeń białkowych czy RNA umożliwia nam lepsze uwidocznienie cząsteczek.
Pozostałe w roztworze krótkie DNA również możemy spróbować zobaczyć. Jest ono niestety na tyle rozproszone, że gołym okiem było by to trudne. Jednak po dodaniu barwników wiążących się z DNA takich jak błękit metylenowy możemy i zauważyć takie DNA. Zdobycie takich barwników nie jest trudne gdyż stosowane są one w akwarystyce. Błękit znajdziecie w sklepach akwarystycznych. Bardzo popularne w akwarystyce są preparaty zawierające zieleń malachitową czy właśnie błękit metylenowy jako preparaty lecznicze. Słyną z tego, że po przypadkowym rozlaniu tworzą trudno zmywalne plamy. Można poeksperymentować używając ich do wybarwiania kwasów nukleinowych.

3) !WŁASNE! DNA gołym okiem!!!

Przygotowujemy bufor z połowy łyżeczki soli, około 10 ml detergentu i wody destylowanej w ilości 100 ml. Źródłem DNA będą komórki wewnętrznej części policzków. Stosuje się je np. do badań na potwierdzenie ojcostwa. Wewnętrzną powierzchnię policzków pociera się wtedy specjalnymi wacikami przypominającymi patyczki do uszu jednak znacznie dłuższymi. Takie waciki są poddawane późniejszej analizie a raczej komórki, które zastały przez nieściągnięte z policzków.
Możemy jednak użyć wacików do uszu delikatnie oskrobując wewnętrzną część policzków. Najlepiej byłoby gdyby były to sterylne patyczki. Te w sklepowych działach kosmetycznych nie są sterylne, takie dostępne są natomiast w sklepie medycznym. Teraz taki patyczek mocno i energicznie płuczemy w probówce z kilkoma mililitrami wody destylowanej, musi to być zrobione dokładnie, więc uderzamy i pocieramy wacikiem o wewnętrzne ścianki probówki by jak najwięcej zebranych komórek przedostało się do wody. Waciki przeznaczone specjalnie do tego celu produkuje kilka firm, za darmo można uzyskaćje zamawiając je na stronie www.GeneTree.com.
Lepiej jednak po prostu wziąć około 25 ml wody destylowanej i płukać nią przez około 30 sekund usta, uważając by jej nie połknąć. Możemy teraz wypluć zawartość jamy ustnej do naczynia. Na 2 ml wypłuczyn dodajemy 1 ml oziębionego buforu i kilkakrotnie mieszamy uważając by zbytnio nie spienić roztworu. Jeśli ktoś jest bardzo ambitny może pokusić się o przeprowadzenie polimeryzowej reakcji łańcuchowej w celu powiększenia otrzymanej ilości DNA., ale do tego trzeba już posiadać kilka odczynników i primerów. Reakcje PCR można przeprowadzić w warunkach amatorskich jednak pamiętać należy o tym, że technika ta jest niezmiernie wrażliwa na zanieczyszczenia. Nie obędzie się, więc bez jednorazowych gumowych rękawiczek do kupienia w aptece czy każdym sklepie ze sprzętem medycznym. Wszystkie szklane naczynia użyte w doświadczeniu muszą być dokładnie myte i płukane. Nie obejdzie się bez zamykanych korkiem probówek bądź też ependorfów z własnym zamknięciem. Właśnie takie techniki analiz zalecane są dla naukowców pracujących w terenie w krajach najuboższych, jeśli nie ma funduszu na prawdziwy profesjonalny sprzed do laboratorium.
Musimy teraz zniszczyć błony komórkowe nabłonka jam policzkowych. Robimy to ostrożnie gotując wodę przez około 2 minuty. Ma to na celu otwarcie komórek i wypłynięcie z nich materiału genetycznego. Oczywiście oprócz DNA uwalniamy także inne makromolekuły będące składnikiem komórek. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej musimy oddzielić fragmenty struktur komórkowych od cząsteczek rozpuszczonych w wodzie. Stosujemy do tego mikrowirówki, więc przyda się tu jakaś amatorska konstrukcja. Po wirowaniu
otrzymujemy próbkę, którą możemy przechowywać w lodzie.
Następny problem to odmierzanie niewielki ilości płynu. Drogie pipety nie wchodzą w grę, więc rozwiązaniem może być zastosowanie plastikowych rurek np. słomek do napojów czy pustych wkładów od długopisów. Ważne by były przezroczyste, i należy je wcześniej skalibrować. Pomocna w tym może być strzykawka "insulinówka".
Teraz jednak najtrudniejsza rzecz, czyli wykonanie mixu PCR. Tych składników w kuchni nie znajdziemy, więc w tym miejscu kończy się całkowita amatorszczyzna. Być może komuś wpadnie w ręce zestaw, "demo" czyli darmowy reklamowy komplet odczynników do pojedynczych analiz. Bufor utrzymuje stałe pH reakcji, primery są krótkimi fragmentami DNA więżącymi się z określonymi miejscami na ludzkim DNA i definiują, gdzie rozpocząć ma prace polimeraza, która to składa dNTPy. Magnez stabilizuje całość reakcji enzymatycznej.
Jeśli pokonaliśmy tę trudność możemy przystąpić do dalszej pracy. Przygotowujemy kilka probówek z mieszaniną reakcyjną i dodajemy do nich nasz roztwór DNA. Pamiętamy by do jednej z probówek nie dodawać DNA tylko zostawić sam PCR mix. Pozwoli nam ona sprawdzić czy nasza analiza nie jest zanieczyszczona obcym DNA. Teraz możemy rozpocząć proces PCR. Zamiast drogiego termocyklera zastosujemy łaźnie wodne, pomiędzy którymi przenosić będziemy próbki. W ten sposób będziemy przeprowadzać reakcje w sposób przypominający początki tej metody. Niezbędne okażą się łaźnie wodne zrobione przy pomocy sprzętu akwarystycznego.
Rozpoczynamy cykl PCR przez rozdzielenie DNA w wysokiej temperaturze, czyli w około 94C. Podwójna helisa denaturuje, czyli rozwinie się i rozdzieli na pojedyncze nici po około minucie. Zamykamy teraz probówki by ograniczyć parowanie i zaczynamy kolejne etapy.
Obniżamy teraz temperaturę do około 60C na około 90 sekund. W tym momencie primery powinny oflankować sekwencje w rozdzielonych niciach DNA. Następnie podnosimy temperaturę do 72C na kolejne 90 sekund, pozwalamy by termostabilna polimeraza rozpoczęła syntezę nowych nici. Cykl taki powtarzamy 30 razy.
Po owych trzydziestu cyklach powinniśmy uzyskać zwielokrotnienie nałożonego materiału genetycznego, we wszystkich probówkach oprócz kontrolnej. Oczywiście nie robiliśmy tej analizy w celach stricte naukowych, więc mówi się trudno i próbujemy zobaczyć to, co mamy.

Bibliografia:
http://www.malina.webd.pl/
http://pl.wikipedia.org/wiki/
http://prace.sciaga.pl/19798.html
http://biologia.servis.pl/muflon.php
http://republika.pl/gmwh/index/badania.htm
„Genetyka ogólna i molekularna” autorstwa Wacława Gajewskiego wyd. PWN