Biochemia

Aminokwasy

Aminokwasy są połączeniami zawierającymi w swoim składzie cząsteczkowym przynajmniej jedną grupę funkcyjną karboksylową –COOH i jedną aminową –NH2.
Wszystkie α-aminokwasy z wyjątkiem najprostszego, tj. glicyny są optycznie czynne, ponieważ atom węgla, z którym związana jest grupa karboksylowa i aminowa jest asymetryczny.

01 - Reakcja van Slyke’a z kwasem azotowym (III) –
W jednej probówce umieścić 1 cm3 10% roztworu NaNO2 i dodać taką samą objętość lodowatego CH3COOH. Po zmieszaniu obu płynów wydzielają się żółte dymy mieszaniny tlenków azotu o charakterystycznej woni. W drugiej probówce zmieszać 1 cm3 10% roztworu NaNO2 z 2 cm3 0,5 M roztworu glicyny, a następnie dodać 1 cm3 lod. CH3COOH. Z probówki wydzielają się bezbarwne i bezwonne pęcherzyki azotu.
02 - Reakcja Srensena z aldehydem mrówkowym
Do 10 cm3 roztworu glicyny w erlenmajerce dodać kilka kropel fenoloftaleiny i kroplami z biurety wprowadzić roztwór NaOH do słabo różowego zabarwienia. Równocześnie do oddzielnej erlenmajerki wprowadzić 10 cm3 roztworu formaldehydu, kilka kropel fe-noloftaleiny oraz kroplami roztwór NaOH do słabo różowego zabarwienia. Następnie roztwór formaldehydu wlać do roztworu glicy-my i obydwa roztwory zmieszać. Zawartość kolbki miareczkować do momentu pojawienia się różowego zabarwienia, utrzymującego się kilka min.
03 - Reakcja z ninhydryną
Do 1 cm3 roztworu glicyny dodać 0,5 cm3 roztworu ninhydryny i ogrzać. Pojawia się niebiesko-fiołkowe zabarwienie.

Reakcje charakterystyczne dla wybranych α-aminokwasów

01 - Wykrywanie cysteiny i cystyny. Reakcja cystynowa
Do 1 cm3 roztworu cysteiny lub cystyny w probówce dodać 2 cm3 roztworu NaOH i ogrzewać do wrzenia przez kilka minut. Następ-nie wprowadzić kilka kropel roztworu Pb(CH3COO)2 i ponownie ogrzać. Z roztworu wydziela się brunatno-czarny osad siarczku oło-wiu (II) PbS.
02 - Wykrywanie metioniny metodą McCarthy-Sullivana
Do 2,5 cm3 roztworu metioniny w probówce dodać 0,5 cm3 stęż. NaOH, 3 krople roztworu nitroprusydku sodu oraz 0,5 cm3 glicyny. Równocześnie w drugiej probówce wykonać próbę ślepą, używając wody destylowanej zamiast metioniny. Obie probówki umieścić w zlewce z ciepłą wodą w temp. 40-80o i pozostawić na 10 min. nie doprowadzając do wrzenia. Następnie oziębić i dodać 5 cm3 stęż. HCl. W próbie ślepej powstaje zabarwienie żółtozielone, natomiast w probówce z metioniną różowobrunatne, nasilające się w ciągu kilku minut
03 - Wykrywanie grup tiolowych. Reakcja z nitroprusydkiem sodu
a. Do 1 cm3 świeżo sporządzonego roztworu cysteiny dodać 1 cm3 roztworu nitroprusydku sodu, nasycić sierczanem(VI) amo-nu i zalkalizować zasadą amonową. Pojawia się barwa czerwonofiołkowa.
b. Powyższą próbę wykonać z 1 cm3 roztworu cystyny. Odczyn jest negatywny.
c. Do 1 cm3 roztworu cystyny zalkalizowanej zasadą amonową dodać kilka kropel roztworu NaCN, nasycić sierczanem(VI) amonu i zmieszać. Tworzy się czerwonofiołkowy barwnik.
04 - Wykrywanie aminokwasów aromatycznych. Reakcja ksantoproteinowa
Do 1 cm3 roztworu tyrozyny dodać 2 cm3 stęż. HNO3 i lekko podgrzać. Roztwór zabarwia się na kolor żółty. Następnie probówkę oziębić i zawartość zalkalizować stęż. NH3*aq lub NaOH. Żółta (pierwotna) barwa roztworu pogłębia się, przechodząc w pomarań-czową.
05 - Wykrywanie tyrozyny. Reakcja Millona
Do 1 cm3 roztworu tyrozyny dodać kilka kropel odczynnika Millona i ogrzać małym płomieniem. Pojawia się czerwone zabarwienie.
06 - Wykrywanie tryptofanu
a. Reakcja Adamkiewicza-Hopkinsa – Do 1 cm3 roztworu tryptofanu dodać kilka kropel kwasu glioksalowego i podwarstwić stężo-nym H2SO4. Na granicy zetknięcia obu płynów powstaje fiołkowy pierścień.
b. Reakcja Voiseneta – Do probówki wprowadzić 1 cm3 roztworu tryptofanu, kroplę roztworu aldehydu mrówkowego oraz 6-7 cm3 stęż. HCl. Zawartość probówki wytrząsnąć, a następnie pozostawić w spokoju przez 5 min. Po tym czasie dodawać bardzo wolno kroplami roztwór azotanu (III) sodu. Pojawia się fiołkowe zabarwienie.
07 - Wykrywanie histydyny. Reakcja Pauly’ego
Do 5 cm3 roztworu kwasu sulfanilowego dodać 0,5 cm3 0,5% NaNO2 przy równoczesnym chłodzeniu probówki zimną wodą. Utwo-rzony roztwór soli diazoniowej zalkalizować Na2CO3 subst. i wlać do 1 cm3 roztworu histydyny. Powstaje pomarańczowożółty barw-nik azotowy.
08 - Wykrywanie argininy. Reakcja Sakaguchi’ego
Do 1 cm3 roztworu argininy dodać 1 cm3 roztworu NaOH, 2-3 krople roztworu α-naftolu i dobrze wymieszać. Następnie wprowadzić kroplę wody bromowej. Tworzy się natychmiast różowopomarańczowy barwnik.


Węglowodany
Węglowodany (sacharydy, cukrowce) są aldehydowymi lub ketonowymi pochodnymi alkoholi wielowodorotlenowych (jedna grupa OH utleniona do grupy aldehydowej lub ketonowej) względnie produktami kondensacji tych związków.
Węglowodany można podzielić na:
• cukrowce proste czyli monosacharydy,
• cukrowce złożone, spośród których wyodrębniamy:
o oligosacharydy – czyli kilkocukrowce, których cząsteczki zbudowane są z kilku (2-6) reszt cukrów prostych,
o polisacharydy – czyli wielocukrowce, których cząsteczki zbudowane są z kilkuset do kilku tysięcy reszt monosacharydów
Podział cukrów na proste i złożone uzasadniony jest zachowaniem się tych związków wobec czynników hydrolitycznych. Cukrow-ce złożone ulegają hydrolizie, której produktami końcowymi są zawsze cukry proste, natomiast monosacharydy nie hydrolizują.
Wszystkie cukry, zarówno proste jak i złożone, są związkami optycznie czynnymi, tzn. wykazują zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego o pewien kąt w prawo lub w lewo. Przyczyną czynności optycznej cukrów jest asymetryczna budowa ich cząsteczek , spowodowana obecnością asymetrycznych atomów węgla.

01 - Reakcje ogólne cukrów
a. Reakcja Molischa z α-naftolem – Do 1 cm3 roztworu dowolnego cukru dodać dwie krople odczynnika Molischa, zamieszać, a następnie podwarstwić 2 cm3 steż. H2SO4. Na granicy obu płynów powstaje fiołkowy pierścień.
b. Reakcja z tymolem – Do 1 cm3 roztworu dowolnego cukru dodać kilka kropli roztworu tymolu, zmieszać i podwarstwić 2 cm3 stęż. H2SO4. W miejscu zetknięcia się obu płynów powstaje różowy pierścień.
02 - Reakcje na wykrywanie pentoz
a. Reakcja Tollensa z floroglucyną – Do 1 cm3 stęż. HCl, kryształek floroglucyny i ogrzać do wrzenia. Powstaje zabarwienie różowe, a po ostudzeniu, przy większej zawartości pentozy, wydziela się fiołkowy osad.
b. Reakcja Biala z orcyną – Do 1 cm3 roztworu pentozy dodać 1 cm3 stęż. HCl, szczyptę orcyny i ogrzać do wrzenia. Roztwór zabarwia się na zielono, a przy większym stężeniu pentozy wytrąca się ciemnozielony osad.
c. Reakcja Taubera z benzydyną – Do 3 cm3 odczynnika Taubera dodać dwie krople roztworu pentozy i ogrzać do wrzenia. Występuje czerwonowiśniowe zabarwienie. Reakcja ta może być stosowana do wykrywania pentoz w moczu, gdyż inne składniki moczu nie mają wpływu na wynik reakcji. Heksozy w powyższych reakcjach dają zabarwienie żółte lub brunatne, dzięki czemu moż-na odróżnić pentozy od heksoz.
03 - Reakcja Seliwanowa z rezorcyną na wykrywanie ketoz
Do 1 cm3 roztworu fruktozy (lub sacharozy) dodać 2 cm3 roztworu HCl, kryształek rezorcyny i ogrzewać do wrzenia 30 sek. Powstaje czerwonowiśniowe zabarwienie, a po oziębieniu osad tej samej barwy.
04 - Właściwości redukcyjne monosacharydów
a. Reakcja Mohra – Do 1 cm3 roztworu glukozy dodać 2 cm3 30%-owego NaOH i ogrzewać do wrzenia kilka minut, energicznie wstrząsając probówką. Pierwotnie bezbarwny płyn przyjmuje najpierw zabarwienie żółte, później brunatne, przyczym wydziela się zapach przypalonego cukru (karmelu). Analogiczna próba przeprowadzona z roztworem sacharozy daje wynik negatywny.
b. Reakcja Tollensa(lustra srebrnego) – Do 5 cm3 roztworu AgNO3 w czystej probówce dodaje się kroplami NH4OH, aż powstają-cy osad AgOH rozpuści się. Do otrzymanego roztworu wprowadza się 1 cm3 roztworu cukru, miesza i umieszcza probówkę w zlewce z ciepłą wodą ogrzewając ją niewielkim płomieniem. Po pewnym czasie na ściankach probówki wydziela się srebro w postaci „lu-stra”.
c. Reakcja Trommera – Do 2 cm3 roztworu cukrowca dodać taką samą objętość NaOH, a następnie kroplami rozcieńczony roztwór CuSO4, dopóki wydzielający się osad Cu(OH)2 przechodzi do roztworu. Uzyskuje się ciemnoniebieski roztwór, z którego po ogrzaniu wydziela się pomarańczowy osad Cu2O.
d. Reakcja Fehlinga – W probówce zmieszać po 2 cm3 odczynnika Fehlinga I i II, dodać 1 cm3 roztworu cukru i ogrzać. Powstaje osad Cu2O.
e. Reakcja Benedicta – Do 5 cm3 odczynnika Benedicta dodać 6-8 kropli 1%-owego roztworu cukru i ogrzać. Wytrąca się osad Cu2O. Reakcja Benedicta jest najbardziej czuła ze wszystkich reakcji redukcyjnych cukrów.
f. Reakcja Barfoeda – Do jednej probówki odmierzyć 1 cm3 roztworu glukozy, do drugiej 1 cm3 roztworu laktozy. Do obu probó-wek dodać po 3 cm3 odczynnika Barfoeda i ogrzewać 3 min. we wrzącej łaźni wodnej. W obecności cukrów prostych wytwarza się w tym czasie osad Cu2O, natomiast w obecności dwucukrów dopiero po ok. 10 min. ogrzewania.
g. Reakcja Nylandera – Do 4 cm3 roztworu cukru dodać 1 cm3 odczynnika Nylandera i ogrzewać łagodnie do wrzenia. Płyn stop-niowo ciemnieje, a w końcu staje się czarny, wskutek wydzielania się czarnego osadu bizmutu.
h. Redukcja kwasu pikrynowego – Do 1 cm3 roztworu cukrowca dodać 3 cm3 roztworu kwasu pikrynowego i zalkalizować roztwo-rem NaOH. Powstaje pikrynian sodu, który po ogrzaniu przechodzi w pikraminian sodu o barwie czerwonej.
05 - Powstawanie osazonów
a. Reakcja z fenylohydrazyną – Do probówki wsypać małą łyżeczkę mieszaniny chlorowodorku fenylohydrazyny i octanu sodu, dodać 5 cm3 roztworu cukrowca, dokładnie wymieszać i wstawić do zlewki z wodą. Zlewkę ogrzewać ok. 30-45 min. W tym czasie z gorących jeszcze roztworów wytrąca się dopiero po oziębieniu. Otrzymane osazony obejrzeć pod mikroskopem i narysować kształty kryształów różnych osazonów.

Mutarotacja – zachodzi w wodnych roztworach monosacharydów i niektórych oligosacharydów i polega na zmianie wartości licz-bowej kąta skręcania płaszczyzny polaryzacji. Spowodowane to jest stopniowym przechodzeniem formy α w β

Glikozydy – monosacharydy, jako związki o charakterze półcetali (półketali), mogą dalej reagować z alkoholami, tworząc połączenia typu acetali. Szczególnym rodzajem acetali są glikozydy czyli związki, których cząsteczki składają się z reszty cukrowej i tzw. agli-konu.

Fermentacja – jednym z najlepiej poznanych rodzajów fermentacji jest fermentacja alkoholowa. Polega ona na beztlenowym rozkła-dzie heksoz na etanol i CO2, przy udziale enzymów zawartych w drożdżach.

Disacharydy – są produktami kondensacji dwóch cząsteczek monosacharydów, z równoczesnym wydzieleniem jednej cząsteczki wody. Dwucukry mogą być jednolite względnie mieszane, zależnie od tego, czy są produktami kondensacji samych pentoz lub hek-soz, czy też pentoz i heksoz.

Polisacharydy – stanowią zasadniczą formę występowania węglowodanów w żywych komurkach. W zależności pełnionych funkcji biologicznych można je podzielić na pilisacharydy zapasowe. Polisacharydy zgodnie z ich strukturą chemiczną dzielimy na: homogli-kany, których cząsteczki zbudowane są z reszt tych samych monosacharydów oraz na heteroglikany, których cząsteczki zbudowane są z reszt różnych monosacharydów.

o Skrobia – jest zapasowym cukrem roślinnym, gromadzonym głównie w nasionach, owocach i bulwach. Węglodanowa część skrobi jest mieszaniną dwóch glukanów, amylozy i amylopektyny, występujących w różnych stosunkach ilościowych, zależnie od pocho-dzenia skrobi.

a. Hydroliza kwasowa skrobi
Ustawić w statywie 8 probówek i do każdej wprowadzić po 2 krople rozcieńczonego płynu Lugola. Następnie do kolbki stożkowej na 100 cm3 odmierzyć 25 cm3 roztworu skrobi, 10 cm3 10%-owego roztworu H2SO4 i dokładnie wymieszać. Z roztworu tego pobrać ok. 2 cm3 płynu i wprowadzić do pierwszej probówki. Powstaje ciemnoniebieski zabarwienie roztworu. Pozostały w kolbce roztwór, ogrzewać do łagodnego wrzenia i co 1 minutę pobierać 2 cm3 hydrolizatu do kolejnych probówek
o Glikogen – (skrobia zwierzęca) jest wielocukrem zapasowym zwierząt, odkładanym głównie w wątrobie i mięśniach.
a. Zachowanie się glikogenu wobec odczynników utleniających przed hydrolizą i po hydrolizie.
Do 1 cm3 roztworu glikogenu w probówce dodać 2 cm3 odczynnika Fehlinga i ogrzać do wrzenia. Odczynniki Fehlinga nie ulega re-dukcji.
5 cm3 roztworu glikogenu w niewielkiej zlewce ogrzewać do wrzenia przez 3-4 min. z 3 cm3 roztworu HCl. Po ostudzeniu zobojętnić roztworem NaOH, dodać odczynnik Fehlinga i ponownie ogrzać. Wytrąca się ceglasty osad Cu2O, potwierdzający zajście hydrolizy i powstanie glukozy, o własnościach redukcyjnych.
o Celuloza – (błonnik) jest najbardziej rozpowszechnionym polisacharydem roślinnym. Nierozpuszcza się w żadnym ze znanych rozpuszczalników i nie tworzy roztworów koloidalnych.


Kwasy nukleinowe

Kwasy nukleinowe są wielkocząstkowymi związkami, zbudowanymi z mniejszych jednostek zwanych nukleotydami, które dają się hydrolitycznie rozłożyć na kwas ortofosforowy(V) i nukleozydy, a e ostatnie na cukier (pentozę) oraz zasady purynowe i pirymidy-nowe. Zależnie od rodzaju reszty cukrowej rozróżniamy:
1. kwasy rybonukleinowe (RNA), zawierające resztę rybozy
2. kwasy deokrytybonukleinowe (DNA), zawierające resztę 2-deoksyrybozy.
Nukleozydy – dą N-glikozydami zasad azotywych (pirymidynowych i purynowych) z pentozą (rybozą względnie deoksyrybozą).
Nukleotydy – są estrami kwasu ortofosforowego(V) i nukleozydów.

01 - Hydroliza kwasów nukleinowych
Do próbówki wprowadzić 5 cm3 roztworu kwasu nukleinowego (RNA i DNA) i dodać taką samą objętość H2SO4. Zawartość pro-bówki ogrzewać w łaźni wodnej przez 45 minut. Otrzymany hydrolizat zachować do dalszych doświadczeń.
02 - Wykrywanie pentoz
a. Reakcja Biala – Do czterech probówek wprowadzić kolejno po 1 cm3 roztworów: rybozy, deoksyrybozy, hydrolizatu RNA, hy-drolizatu DNA. Do każdej probówki dodać 5 cm3 odczynnika Biala i ogrzewać, utrzymując we wrzeniu przez kilkanaście sekund. W każdej probówce pojawia się zielone zabarwienie.
b. Reakcja Dischego – Do czterech probówek wprowadzić kolejno roztwory po 1 cm3 roztworów: rybozy, deoksyrybozy, hydroliza-tu RNA, hydrolizatu DNA. Do każdej probówki dodać 2 cm3 odczynnika Dischego i ogrzewać we wrzącej łaźni przez około 10 min. W obecności deoksyrybozy występuje fiołkowe zabarwienie.
03 - Wykrywanie zasad purynowych i pirymidynowych
a. Wytrącanie zasad purynowych – Do 1 cm3 wrzącego hydrolizatu dodać rozcieńczonego kwasu octowego do słabo kwaśnego od-czynu (sprawdzić za pomocą papierka uniwersalnego). Ogrzać do wrzenia, a następnie wprowadzić parę kropli 10%-owego CuSO4 oraz ostrożnie kroplami nasyconego roztworu NaHSO3. Wytrąca się żółty osad.
b. Wytrącanie zasady purynowych i pirymidynowych – W pięciu probówkach umieścić kolejno kryształek: adeniny, guaniny, cyto-zyny, uracylu, tyminy. Do każdej probówki wprowadzić po 0,1 cm3 roztworu amoniaku i po całkowitym rozpuszczeniu związku do-dać 0, 5 cm3 roztworu azotany(V) srebra. Próbki wytrąconych, krystalicznych osadów obejrzeć pod mikroskopem. Następnie do dwóch probówek wprowadzić oddzielnie po 1 cm3 hydrolizatu RNA oraz DNA. Do każdej z nich dodać po 1 cm3 roztworu azota-nu(V) srebra. Wytrącone osady obejrzeć pod mikroskopem i porównać z kryształami czystych zasad.
04 - Wykrywanie kwasu ortofosforowego(V)
Do dwóch probówek wprowadzić oddzielnie po 1 cm3 hydrolizatu RNA i DNA. Do każdej probówki dodać 3 cm3 roztworu mo-libdenianu amonu i ogrzać do wrzenia. Pojawia się zółte zabarwienie, a następnie osad fosforomolibdenianu amonu. Po oziębieniu probówek dodać do każdej 1 cm3 reduktora metalowego. Tworzy się błękit molibdenowy.


Lipidy (tłuszczowce)












Zarówno tłuszcze proste, jak i złożone, są związkami o charakterze estrów. W składzie tłusczów prostych można wyróżnić kom-ponent alkoholowy i kwasowy, natomiast w tłuszczach złożonych, oprócz tych dwóch składników, występują jeszcze reszty kwasu ortofosforowego, zasad organicznych, aminoalkoholi lub cukrów.
Tłuscze proste, ze względu na jakość składnika alkoholowego, dzielimy na tłuszcze właściwe (zawierające resztę glicerolu) oraz wo-ski (zawierające reszty wyższych alkoholi jednowodorotlenowych).

01 - Wykrywanie glicerolu
W suchej probówce umieścić grudkę tłuszczu lub kroplę oleju, dodać bezwodnego KHSO4 i ogrzewać. Po pewnym czasie wydziela-ją się z probówki „dymy” akroleiny o drażniącym zapachu. Pasek bibuły zwilżony roztworem wodorotlenku diamoniakalno-srebrowego, umieszczony u wylotu probówki, ciemnieje, wskutek redukujących właściwości akroleiny.
02 - Reakcja zmydlania tłuszczów właściwych
Doświadczenie rozpocząć od zagotowania ok. 100 cm3 wody destylowanej. Następnie w parownicy umieścić ok. 2 g. tłuszczu, roz-topić go i dodać 5 cm3 30%-owego roztworu NaOH oraz kilka cm3 etanolu. Ogrzewać łagodnie, ciągle mieszając, aż do utworzenia jednolitej masy mydlanej. Masę tę należy przenieść do zlewki z gorącą wodą i ogrzewać, mieszając, aż mydło rozpuści się, tworząc koloidalny roztwór. Roztwór ten zachować do dalszych doświadczeń.
03 - Badanie właściwości mydeł
a. Obniżanie napięcia powierzchniowego – Do dwóch probówek zawierających po 4 cm3 wody dest. dodać kilka kropli oleju. Do jednej z nich wprowadzić 1 cm3 roztworu mydła. Zawartość obu probówek silnie wstrząsnąć. W probówce zawierającej środek emul-gujący (mydło) tworzy się trwała emulsja tłuszczu w wodzie, podczas gdy w drugiej probówce, drobne kuleczki tłuszczu połączą się w większe i po chwili, na powierzchni wody zbierze się warstwa tłuszczu.
b. Wysalanie mydła – Do probówki z 5 cm3 roztworu mydła wprowadzać porcjami stały NaCl, aż do wysycenia roztworu. Wytrąca się kłaczkowaty osad mydła, który rozpuszcza się, po dodaniu wody w nadmiarze.
c. Otrzymywanie mydła nierozpuszczalnego w wodzie – Do trzech probówek zawierających po 2 cm3 roztworu mydła wprowadzić roztwory CaCl2, MaCl2 i (CH3COO)2Pb. Wytrącają się osady odpowiednich mydeł, które nie rozpuszczają się w nadmiarze wody, a więc wytrącanie, nie jest w tym przypadku procesem wysalania.
d. Wydzielanie z mydeł wolnych kwasów tłuszczowych – Do 50 cm3 roztworu mydła dodawać ostrożnie, kroplami, stęż. H2SO4, aż roztwór wykaże odczyn kwaśny. Wytrąca się mieszanina nierozpuszczalnych w wodzie kwasów tłuszczowych, która zabiera się na powierzchni cieczy.
04 - Wykrywanie nienasyconych kwasów tłuszczowych
a. Reakcja z manganianem(VII) potasu – Do probówki zawierającej kilka kropwl oleju dodać 5 cm3 roztworu Na2CO3, lekko ogrzać i wstrząsając, dodawać po kropli roztwór KmnO4. Roztwór manganianu(VII) potasu początkowo odbarwia się, a następnie za-czyna się wydzielać brunatny osad MnO2.
b. Reakcja addycji bromu – Kilka kropli oleju rozpuścić w chloroformie i wytrząsać z 1 cm3 wody bromowej. Woda bromowa od-barwia się (dowód, że zachodzi addycja), a warstwa chloroformowa ulega zmętnieniu, ponieważ wytworzona bromowa pochodna na-syconego kwasu tłuszczowego jest w nim nierozpuszczalna.

Woski

Woski są estrami wyższych monokarboksylowych kwasów tłuszczowych i wyższych alkoholi jednowodorotlenowych o parzystych liczbach atomów węgla od C16 do C36.

Sterydy (steroidy)

Sterydy są naturalnymi związkami, występującymi zarówno w organizmach roślinnych, jak i zwierzęcych, najczęściej łącznie z lipi-dami. Sterydy nie są estrami, w odróżnieniu więc od lipidów nie ulegają zmydlaniu, co pozwala na oddzielenie ich od tłuszczów. W zależności od budowy chemicznej i funkcji biologicznej, dzieli się sterydy na: 1. sterole, 2. kwasy żółciowe, 3. hormony sterydowe.

Sterole – są związkami o charakterze alkoholi. Wszystkie sterole posiadają grupy metylowe przy atomach C-10 i C-13, grupę OH przy C-3 oraz rozgałęziony łańcuch węglowodorowy od 8-10 atomów węgla przy C-17.
Cholesterol – to najważniejszy przedstawiciel steroli zwierzęcych. Jest w organizmie materiałem wyjściowym dla wielu innych stery-dów, jak: kwasów żółciowych, hormonów sterydowych kory nadnerczy i gruczołów płciowych oraz witamin D.
01 - Wykrywanie cholesterolu
a. Reakcja Salkowskiego – W suchej probówce umieścić szczyptę cholesterolu i rozpuścić ją w 2 cm3 chloroformu. Następnie dodać taką samą objętość stęż. Kwasu siarkowego. Po rozdzieleniu się warstw obu płynów, górna – chloroformowa zabarwia się na czerwono, natomiast dolna – kwasowa wykazuje zabarwienie żółte, z zieloną fluorescencją. Zabarwienie warstw obu płynów uzależ-nione jest od rodzaju sterolu.
b. Reakcja Liebermanna-Burcharda – W suchej probówce umieścić szczyptę cholesterolu i rozpuścić ją w 2 cm3 chloroformu. Następnie dodać ok. 10 kropli bezwodnika octowego i ostrożnie, po ściankach probówki kilka kropli stęż. Kwasu siarkowego(VI). Roztwór przyjmuje kolejno zabarwienie: czerwone, fioletowe, niebieskie i w końcu zielone.
c. Reakcja Windausa – Sporządzić etanolowy lub eterowy stężony roztwór cholesterolu i dodawać stopniowo roztworu bromu w lod. Kwasie octowym tak długo, aż roztwór przestanie się odbarwiać. Po kilku sekundach płyn krzepnie – powstają kryształy 5,6-dibromocholesterolu. Reakcja ta pozwala stwierdzić obecność podwójnego wiązania w cząsteczce cholesterolu.
02 - Wykrywanie ergosterolu
a. Reakcja Rosenheima – Do dwóch suchych probówek wprowadzić oddzielnie po 1 cm3 ergosterolu i cholesterolu, a następnie po 2 cm3 stęż. roztworu kwasu trichlorooctowego.
b. W obecności ergosterolu pojawia się zabarwienie różowe, przechodzące następnie w niebieskozielone.


KWASY ŻÓŁCIOWE

Są hydroksylowymi pochodnymi kwasu cholanowego, w którym, w różnych miejscach zamiast atomów wodoru, podstawione są gru-py OH. Kwasy żółciowe są głównymi składnikami żółci, a ich biosynteza przebiega w wątrobie, z cholesterolu.

Płyny ustrojowe

MLEKO

Mleko jest trwałą emulsją kropelek tłuszczu w roztworze wodnym zawierającym białka, cukier mlekowy(laktozę) i sole mineralne.

Badanie odczynu mleka.
Papierkiem uniwersalnym zbadać odczyn mleka świeżego i stojącego przez pewien czas. Porównać wyniki.
Oznaczenie kwasowości mleka.
Do erlenmajerki odmierzyć 10cm3 mleka, dodać 20 cm3 wody dest., parę kropel fenoloftaleiny i miareczkować O,1 M NaOH do słabo różowego zabarwienia.
Ilość cm3 NaOH pomnożona przez 10 daje kwasowość mleka w stopniach.
Wykrywanie cukru w mleku.
Do 2 cm3 przesączu dodać taką samą objętość odczynnika Fehlinga i ogrzać. Pojawia się ceglasty osad tlenku miedzi(I), świadczący o obecności cukru.
Wyosobnienie kazeiny z mleka.
Ogrzać w zlewce 100 cm3 wody dest. Do 38%C, dodać 50 cm3 mleka, a następnie mieszając, dodawać kroplami 1% roztwór kwasu octowego, aż do pojawienia się kłaczkowatego osadu. Po kilku minutach, kiedy osad opadnie na dno, należy go odsączyć, a Przesącz zachować do dalszych analiz.
Z osadu usunąć wodę przez wyciśnięcie między dwoma arkuszami bibuły, a następnie umieścić go w suchej zlewce i przemyć 20 cm3 etanolu. Po odlaniu etanolu przemywa się osad 20 cm3 eteru, ponownie dekantuje, suszy między dwoma arkuszami bibuły, a na-stępnie na powietrzu. Wysuszony osad kazeiny rozpuścić w O,1 M roztworze NaOH i przeprowadzić reakcje charakterystyczne na białka, np. reakcję ksantoproteinową i biuretową.
Wykrywanie jonów Ca2+. Do 1 cm3 przesączu dodać 1 cm3 nasyconego roztworu szczawianu amonu. Wytrąca się biały osad szczawiany wapnia (COO)2Ca.
Wykrywanie jonów Cl-. Do 1 cm3 przesączu dodać kulka kropli stęż. HNO3, a następnie 1 cm3 roztworu AgNO3. Wytrąca się biały, serowaty osad AgCl.
Wykrywanie jonów PO3-4. Do 1 cm3 przesączu dodać 1 cm3 stęż. HNO3 i 3 cm3 molibdenianu (VI) amonu. Ogrzać do wrzenia. Po oziębieniu wytrąca się żółty osad fosforomolibdenianiu amonu.
Odtłuszczenie mleka
3 cm3 mleka wstrząsać w probówce z taką samą objętością eteru. Po rozdzieleniu płynów nie ma widocznej zmiany w warstwie mle-ka. Po dodaniu kilku kropel 2 M NaOH i ponownym wstrząsaniu, płyn dzieli się na dwie różniące się warstwy: dolną – klarowną, za-wierającą białka i górną – eterową zawierającą tłuszcz.
Poprzez dodanie NaOH powstaje rozpuszczalna sól słodowa kazeiny, której roztwór, w przeciwieństwie do obecnych w mleku soli wapniowych kazeiny, nie opalizuje.
Wykrywanie kwasu mlekowego w zsiadłym mleku.
Do 10 cm3 wody dest. Dodać kilka kropel 10%-owego roztworu FeCl3, oraz 1 cm3 oraz 1 cm3 serwatki. Powstaje zabarwienie „kanar-kowe”.
Odróżnienie mleka surowego od gotowanego.
Do 2cm2 surowego mleka dodać 2cm2 roztworu benzydyny w lod. kwasie octowym oraz parę kropel H2O2. Występuje niebieskie za-barwienie. Powtórzyć doświadczenie z mlekiem przegotowanym.


ŚLINA

Ślina jest pierwszym sokiem trawiennym działającym na pobrany pokarm, wydzielanym przez gruczoły ślinowe przyuszne, pod-szczękowe i podjęzykowe. Jest płynem bezbarwnym, lepkim, słabo opalizującym.


Wykrywanie białka w ślinie.
1 cm3 śliny zadać 1 cm3 10%owego NaOH i paroma kroplami 1%-owego CuSO4. Powstaje fiołkowe zabarwienie.
Wytrącanie mucyny i wykazanie w niej obecności cukru.
Do 5 cm3 śliny dodawać kroplami 0,1 M kwasu octowego. Wytrąca się klaczkowaty osad mucyny. Osad ten zebrać bagietką i prze-nieść do innej probówki. Dodać 3 cm3 stęż. HCl i ogrzewać kilka minut. Pojawia się fioletowe zabarwienie. Analogiczne doświad-czenie można przeprowadzić wprost ze śliną.

KREW

Krew, będąca jedyną płynną tkanką ustroju, znajduje się w ciągłym ruchu w układzie krążenia. Spełnia ona rolę łącznika między po-szczególnymi tkankami i narządami, przyczyniając się w znacznym stopniu do utrzymania stałości środowiska wewnętrznego. Krew składa się z ok. 55% płynnego osocza, a pozostały procent stanowią zawieszone w nim krwinki, głównie erytrocyty, leukocyty i płytki krwi.
Osocze stanowi roztwór wodny przede wszystkim białek – albumin i globulin, nadto cukrów, lipidów, kwasu moczowego, kreatyniny, witamin, hormonów i soli mineralnych.
Odbiałczenie surowicy kwasem trichlorooctowym (TCA).
Surowicę rozcieńczyć 4 objętościami wody i dodawać kroplami mieszając 5 objętności 20%-owego TCA. Po 10 minutach odsączyć osad wytrąconego białka, a przesącz zachować do dalszych prób.
Wykrywanie kwasu moczowego.
Do 4 cm3 przesączu dodać kilka kropel odczynnika Folina Denisa i 2 cm3 20%Na2CO3. Roztwór przyjmuje zabarwienie niebieskie.
Wykrywanie kreatyniny.
Do 2cm3 przesączu dodać nasyconego roztworu kwasu pikrynowego, a następnie 1 cm3 10%-owego NaOH. Roztwór przyjmuje po-marańczowe zabarwienie. Równolegle przeprowadzić próbę porównawczą z wodą.
Wykrywanie glukozy.


Wykrywanie tłuszczowców.
Do 1cm3 surowicy dodać 5cm3 1%-owego fenolu w 12%-owym roztworze NaCl. Zawartość próbówki mętnieje.


MOCZ

Mocz jest płynem wytwarzanym w nerkach, a ściślej w ich nefronach. Jest on wydalany z organizmu razem ze szkodliwymi lub zbędnymi końcowymi produktami przemiany materii, głównie produktami przemiany białek i innych związków azotowych.
Normalny mocz ma barwę jasnożółtą, pochodzącą od głównego barwnika moczu urochromu.

1. Próby obecności białka.
a.) Próba z kwasem sulfosalicylowym
Do 4 cm3 moczu dodać 2 krople 30%-owego kwasu octowego i w razie powstanie zmętnienia przesączyć. Dodać następnie po 2 kro-ple 20%-owego kwasu sulfosalicylowego na każdy cm3 moczu. W zależności od ilości białka pojawia się opalescencja, zmętnienie lub wyraźny osad.
b.) Próba koagulacji cieplnej
Do 4 cm3 moczu dodać 0,5 cm3 nasyconego roztworu NaCl, zakwasić 2 kroplami 30%-owego kwasu octowego i zagotować. Jeżeli pojawi się zmętnienie lub osad, to może on pochodzić od zdenaturowanego białka, fosforanu lub węglanu wapni. W celu rozstrzy-gnięcia wątpliwości, należy dodać 3,4 krople 30%-owego kwasu octowego i ponownie zagotować. Jeżeli osad pochodzi od soli wap-nia, uleganie rozpuszczeniu; jeżelu od białka – pozostanie niezmieniony.

2. Wykrywanie cukru.
Jeżeli do 5cm3 odczynnika Benedicta doda się 8 kropli moczu i ogrzeje do wrzenia przez 2 minuty, to na podstawie powstałego za-barwienia można orientacyjnie wnosić o ilość glukozy e badanym moczu. Jeżeli kolor nie zmienił się – glukoza nieobecna, kolor zie-lony bez osadu – 0,1-0,3% cukru, zielony z osadem – 0,5% cukru, oliwkowozielony – 1%, pomarańczowy 1,5%, jasnoczerwony – 2 i więcej % cukru.

3. Wykrywanie ciał ketonowych
Przygotować odczynnik przez dokładne roztarcie 0,5 g nitroprusydku sodu z 20 g siarczanu (VI) amonu oraz 20g bezw. węglanu so-du. Szczyptem mieszaniny zwilżyć analizowanym moczem.
W przypadku obecności ciał ketonowych występuje zabarwienie fioletowe, a w razie ich braku słabo różowe.

4. Wykrywanie mocznika.
Mocznik utlenia się bromianem (I) sodu na azot, wodę i CO2. Ten ostatni wiązany jest przez NaOH na węglan sodu.
CO(NH2)2+3NaOBr+2NaOH→N2+Na2CO3+3NaBr+3H2O
Jest to metoda gazometryczn. Z objętości wydzielonego azotu oblicza się zawartość mocznika, uwzględniając warunki: temperaturę i ciśnienie.
Wykonanie: Do 1cm3 moczu dodać 1cm3 odczynnika bromianowego. Przy zmieszaniu obserwujemy wydzielanie azotu.

Białka

Białka są jednostkami strukturalnymi każdej żywej komórki i podłożem wielu przemian biochemicznych.
Reakcje barwne
Reakcja biuretowa (piotrowskiego)
Do 2 cm3 roztworu białka jaja kurzego w probówce dodać taką samą objętość 10%-owego roztworu NaOH i parę kropel 1% CuSO4. Pojawia się barwa fioletowa.
Reakcje charakterystyczne dla poszczególnych aminokwsów (których reszty są obecne w cząsteczkach białek)
Reakcje wyżej wymienione wykonać z roztworem białka jaja kurzego (2cm3 roztworu białka) stosując odczynniki jak przy wykrywa-niu wolnych aminokwasów
Strącanie białek za pomocą kationów
Do 2 cm3 roztworu białka w probówce dodać kilka kropel 1%-owego roztworu FeCl3. Wytrąca się brunatny osad białczanu żela-za(III), rozpuszczalny w nadmiarze chlorku żelaza(III). Następnie w trzech probówkach umieścić po 2 cm3 roztworu białka i kolejno dodawać kroplami: do pierwszej roztworu HnCl2, do drugiej Pb(NO3)2, a do trzeciej AgNO3. Wytrącają się nierozpuszczalne w wo-dzie ani w nadmiarze odczynnika osady odpowiednich białczanów.
Strącanie białek za pomocą anionów
Do czterech probówek zawierających po 2 cm3 roztworu białka dodać kolejno:2cm3 kwasu truchlorooctowego, kilka kropel kwasu sulfosalicylowego, kwasu pikrynowego i kwasu fosforowolframowego. W każdej probówce wytrąca się białko w formie soli z odpo-wiednim anionem.
Wysalanie białek
Wysalanie białka jaja kurzego (oddzielenie albumin od globulin)
Do 15cm3 roztworu białka jaja kurzego dodać 15cm3 nasyconego roztworu (NH4)2SO4 i zmieszać. Strąca się kłaczkowaty osad globu-lin. Osad odsączyć (lub odwirować) i pozostawić do dalszego doświadczenia, a przesącz zebrać w niewielkiej zlewce. Do przesączu dodawać małymi porcjami stały sproszkowany siarczan amonu do stanu nasycenia, tj. tak długo, dopóki na dnie zlewki pozostaje kil-ka kryształów nie rozpuszczonej soli. Z roztworu wydziela się osad albumin. Oddzielić osad przez odsączenie lub odwirowanie.
Do każdego osadu – globulin i albumin – oddzielnie, dodać wody dest. Obserwuje się rozpuszczenie osadów. Z każdym roztworem wykonać próbę biuretową.

Wysalanie białek osocza
Do 15 cm3 osocza dodać 5cm3 nasyconego roztworu (NH4)2SO4 (25% nasycenia). Mieszaninę dokładnie wymieszać i po kilku minu-tach odwirować. Wytrąca się osad fibrynogenu. Płyn znad osadu zdekantować, a osad rozpuścić w 15cm3 0,09% NaCl.. Powstaje opa-lizujący roztwór (frakcja I), w którym należy wykryć białko metodą biuretową. Z probówki zawierającej płyn znad osadu fibrynogenu pobrać 10cm3 i przenieść do suchej probówki. W pozostałości (frakcja II) wykryć białko metodą biuretową. Do pobranych 10 cm3 płynu dodać 5 cm3 nasyconego (NH4)2SO4 (50% nasycenia). Wytrąca się osad globulin. Powstałą mieszaninę po 10 min. wirować. Osad rozpuścić w 0,09% NaCl i wykonać reakcję biuretową. Pozostały żółtawy roztwór zawiera albuminy (frakcja III). Stwierdzić obecność białka metodą biuretową. W każdej z frakcji (I, II i III) oznaczyć ilościowo białko metodą biuretową i Lowry`ego.

Denaturacja białek
Denaturacja cieplna
Do 2 cm3 białka dodać dwie krople kwasu octowego i ogrzać do wrzenia. Wytrąca się biały osad białka, który staje się obfitszy po dodaniu NaCl lub MgCO4
Działanie etanolu
Do 1 cm3 białka dodać 3 cm3 etanolu. Wytrąca się osad rozpuszczalny w wodzie. Wykonać analogiczną próbę, zostawiając mieszani-nę na godzinę. Po upływie tego czasu osad nie rozpuszcza się.
Działanie stężonego HNO33 (odczyn Hellera)
Do probówki wprowadzić 1 cm3 stęż. HNO3, a następnie ostrożnie, po ścianach pochyło trzymanej probówki dolewać taką samą obję-tość roztworu białka. W miejscu zetknięcia się obu płynów powstaje biały pierścień wytrąconego białka. Na podstawie grubości pier-ścienia można do pewnego stopnia wnioskować o stężeniu białka w roztworze. Reakcja ta ma zastosowanie do wykrywanie białka w moczu.

Enzymy

Enzymy są biologicznymi katalizatorami (biokatalizatorami), wytwarzanymi przez organizmy żywe. Działanie ich polega na przy-śpieszaniu lub nadawaniu odpowiedniego kierunku reakcjom chemicznym zachodzącym w żywej komórce, jak też poza nią.

Wykrywanie katazy
2 cm3 wyciągu ziemniaczanego ogrzać w probówce do wrzenia, oziębić i dodać 1 cm3 H2O2. Wynik reakcji jest negatywny. Pod wpływem wyższej temperatury nastąpiła inaktywacja enzymu – katalazy.

Wykrywanie peroksydazy
Do 2 cm3 wyciągu ziemniaczanego dadać kilka kropel benzydyny i kilka kropel H2O2. Pojawia się niebieskie zabarwienie.
Wykrywanie oksydaz
Do trzech probówek wlać po 5cm3 wyciągu ziemniaczanego. Następnie do każdej probówki wprowadzić kolejno, do pierwszej 10 kropli roztworu fenolu, do drugiej – 10kropli pirokatechiny, do trzeciej – 10 kropli roztworu piragallolu. Zawartość probówek wymie-szać i obserwować zmianę zabarwienia.