Mikroskop optyczny

Przyrząd do otrzymywania powiększonych (ponad 2000 razy) obrazów przedmiotów lub ich szczegółów, niedostrzegalnych dla oka (mniejszych od ok. 0,1 mm). Obrazy dawane przez mikroskop optyczny mogą być obserwowane bezpośrednio okiem (mikroskop optyczny zwykły), fotografowane (mikrofotografia), rzucane na ekran bezpośrednio (mikroskop optyczny projekcyjny) lub po przetworzeniu (mikroskop optyczny telewizyjny). Zasadniczymi częściami zwykłego mikroskopu optycznego są:

1) układ opt. oświetlający, zawierający kondensor
2) układ opt. wytwarzający obraz i składający się z obiektywu wytwarzającego rzeczywisty, odwrócony, znacznie powiększony (do ok. 100 razy) obraz A"B" przedmiotu AB
3) okularu, dającego pozorny, kilkanaście razy powiększony w stosunku do A"B" obraz A"B".

Zastosowanie w mikroskopie optycznym obiektywu zwierciadlanego pozwala na zwiększenie odległości przedmiotu od obiektywu i umożliwia wyposażenie mikroskopu optycznego w dodatkowe elementy: komory grzejne lub chłodzące oraz mikromanipulatory. Podstawowymi wielkościami charakteryzującymi mikroskop optyczny są powiększenie i zdolność rozdzielcza; maks. użyteczne powiększenie jest wyznaczone przez zdolność rozdzielczą, która z kolei jest ograniczona przez dyfrakcję światła; zdolność rozdzielcza mikroskopu optycznego rośnie ze wzrostem apertury i zmniejszeniem długości fali świetlnej. Zależnie od charakteru badań używa się mikroskopów optycznych dostosowanych do obserwacji w różnych zakresach promieniowania: widzialnym, podczerwonym, nadfioletowym (w tych 2 ostatnich przypadkach obrazy są obserwowane za pomocą odpowiednich przetworników); stosuje się też różne metody obserwacji, gł. tzw. metodę jasnego pola (pozwala na obserwację cząstek pochłaniających lub rozpraszających światło cząstka taka daje ciemny obraz na jasnym tle), metodę ciemnego pola (do obiektywu dochodzą tylko promienie rozproszone na cząstkach możliwa jest także obserwacja przedmiotów przezroczystych różniących się od ośrodka współczynnikiem załamania), oraz metodę kontrastu fazowego (do obserwacji obiektów przezroczystych, których różnica grubości lub współczynnika załamania jest przetwarzana w układzie opt. na różny poziom jasności obrazu) i podobną do niej metodę interferencyjną.

Zmiany konstrukcyjne i dodatkowe urządzenia pozwalają na prowadzenie obserwacji zarówno w świetle przechodzącym przez obiekt, jak i odbitym od obiektu, a także przystosowują mikroskop optyczny do specjalnych zadań, m.in. do obserwacji przedmiotów anizotropowych ( mikroskop polaryzacyjny), badania fluorescencyjnych obrazów mikroobiektów oświetlonych promieniowaniem krótkofalowym widzialnym, nadfioletowym (mikroskop optyczny fluorescencyjny), obserwacji stereoskopowej (mikroskop optyczny stereoskopowy), obserwacji cząstek o wymiarach poprzecznych znacznie mniejszych od teoret. zdolności rozdzielczej mikroskopu optycznego (ultramikroskop). Wynalezienie lasera przyczyniło się do zbudowania skanujących mikroskopów optycznych: odbiciowego i fluorescencyjnego, mikroskopu optycznego dopplerowskiego, mikroskopu optycznego elipsometrycznego i in. Mikroskop optyczny został wynaleziony prawdopodobnie 1590 przez Z. van Jansena; ok. 1677 A. Leeuwenhoek zbudował mikroskop optyczny powiększający dobrze ok. 300 razy; podstawy teoret. mikroskopii oprac. 1872 E. Abbe. W 1962 E.N. Leith i J. Upatnieks zbudowali bezsoczewkowy mikroskop optyczny holograficzny. W 1931 roku Ernst Ruska, konstruując mikroskop elektronowy, dokonał rewolucji w biologii. Przy użyciu tego urządzenia stało się możliwe obserwowanie obiektów o wielkości zaledwie jednej milionowej milimetra. Za swoje osiągnięcie Ruska uhonorowany został w 1986 roku Nagrodą Nobla.

Budowa mikroskopu to splecenie dwóch układów: optycznego i mechanicznego. Układ optyczny służy do oświetlenie obiektu oraz powiększenia jego obrazu. Układ mechaniczny ma zapewniać właściwe położenie poszczególnych elementów układu optycznego. Kluczowa jest stabilność, wzajemna równoległość i współśrodkowość składowych układu optycznego; pożądane wszelkie regulacje temu służące.
Elementy mechaniczne to :

Statyw, korpus mikroskopu: zapewnia sztywność całej konstrukcji, generalnie im sztywniejszy i cięższy tym lepiej. Konstrukcja statywu determinuje, czy dla regulacji odległości obiektyw-przedmiot (nastawiania na ostrość) opuszczamy-podnosimy stolik przedmiotowy, czy też wykonujemy te ruchy tubusem (wraz z mocowanymi do niego obiektywami, okularami i innymi akcesoriami). Rozwiązanie pierwsze (podnoszony-opuszczany stolik) jest pod każdym względem lepsze i stosowane w nowszych mikroskopach. Zapewnia ono stałą wysokość okularów - co jest istotne z ergonomicznego punktu wiedzenia. Ważniejsza jest eliminacja wady tradycyjnej konstrukcji w której dla nastawiania ostrości opuszczany-podnoszony jest tubus z obiektywami i innymi elementami. W takim wypadku część ruchoma ma niejednokrotnie znaczny ciężar co powoduje zjawisko samoistnego opadania, \"płynięcia\". Walka z tym wymaga odpowiedniego dobrania oporu stawianego przez śrubę ruchu pionowego i niezależnie od regulacji z upływem czasu ponawia się tendencja do \"płynięcia\". Ta wada wpisana w konstukcję może wręcz uniemożliwić stosowanie ciężkich nasadek fotograficznych lub innych urządzeń umieszczanych na tubusie. Takiej wady nie ma nowoczesna konstrukcja z podnoszonym stolikiem przedmiotowym, którego ciężar jest z reguły nieduży,
Stolik przedmiotowy: służy do umocowania preparatu i jego przesuwu w poziomie w osiach X, Y, w zależności od rozwiązania konstrukcyjnego (patrz uwagi przy statywie mikroskopu) przez jego ruch w pionie reguluje się odległość obiektyw-przedmiot (tj. nastawia się ostrość). Mogę też być stoliki specjalnego przeznaczenia np. obrotowy do pracy w świetle spolaryzowanym.
śruba makro- i mikrometyczna: śruby służące do ustawiania odległości przedmiot-obiektyw (nastawiania ostrości).

W zależności od konstrukcji śruba podnosi-opuszcza stolik przedmiotowy lub tubus z obiektywami. Śruba ruchu drobnego - mikrometryczna, zaopatrzona jest zwykle w poddziałkę mikrometyczną. Może ona wtedy służyć do pomiaru grubości (wysokości) obiektu. Wartości mierzone tą techniką nie odpowiadają wprost odczytowi z podziałki śruby. Opis techniki takiego pomiaru znajdziecie w artykule o pomiarze grubości szkiełka nakrywkowego. Parafokalność: w nowszych modelach mikroskopów (od połowy XX w.) mamy doczynienia z tzw. układem parafokalnym, tzn. różne obiektywy mają niemal tą samą odległość przedmiotową tzn. po nastawieniu ostrości jednym obiektywem, i następnie po zmianie na obiektyw o innym powiększeniu, obraz jest nadal ostro widoczny; ewentualnie wymagana jest nieduża korekta ostrości. W starszych konstrukcjach nie jest to prawdą i przy zmianie obiektywu potrzebna jest nieraz istotna korekta odległości obiektyw-przedmiot.
Rewolwer: obiektywy mikroskopu są osadzone w gniazdach obrotowej tarczy - rewolweru, jego obracanie umożliwia prostą zmianę obiektywu a tym samym używanego powiększenia,
Tubus: przestrzeń pomiędzy obiektywem a nasadką okularową, w której następuje formowanie się obrazu; długość tubusu (tzw. optyczna tubusu) w starszych konstrukcjach jest ustandaryzowana na 160mm (Zaiss i wielu innych) lub 170mm (Laica i nieliczni) i pod jedną lub drugą długość są projektowany obiektywy (ta długość jest wygrawerowana na obiektywach); w nowszych układach (koniec XX w. i obecnie) stosuje się przeważnie tzw. optykę nieskończoną i odpowiednie do tego obiektywy z wygrawerowanym symbolem nieskończoności,
Układ oświetleniowy: w najprostszym przypadku składa się z lusterka, w bardziej złożonych jest to specjalna lampa, z układem kolektora i rozmaitymi regulacjami; oświetlenie jest krytycznym elementem mikroskopowania i znajdziesz tu kilka artykułów poświęconych temu tematowi,
Układ mechaniczny kondensora: pozwala na regulacje położenia kondensora w pionie oraz w bardziej zaawansowanych modelach możliwe jest też centrowanie kondensora względem osi optycznej mikroskopu, niektóre mikroskopy posiadają mechniczną blokadę (hamulec) zabezpieczający przed "wjechaniem" kondensorem w szkiełko przedmiotowe.

Elementy optyczne to:
Oświetlacz: w prostych mikroskopach będzie to lusterko, może też być wbudowana żarówka z reflektorem, lub pełnowymiarowy układ oświetlający z kolektorem, regulacją odległości, centrowaniem, osobnym zasilaniem z regulacją napięcia itd.
Kondensor: jest wtórym źródłem oświetlenia, bezpośrednio oświetla przedmiot,
Szkiełko przedmiotowe, przedmiot, szkiełko nakrywkowe,
Imersja: wypełnienie cieczą przestrzeni pomiędzy szkiełkami a obiektywem i kondensorem,
Obiektywy: zbierają światło wychodzące z przedmiotu i tworzą jego powiększony obraz,
Tubus: tutaj formuje się obraz,

Nasadka okularowa: dłuży do osadzenia okularów i zmiany biegu promieni świetlnych na bardziej ergonomiczy dla obserwatora - pochylony; nasadki okularowe mogą być jednookularowe (w prostszych mikroskopach), dwuokularowe (binokularne) pozwalające na wygodną obserwację dwoma oczami - ważne nie tylko ze względu na ergonomię ale i dla zdrowia, w przypadku nasadek binokularnych może być dostępna regulacja rozstawu okularów (stosownie do odległości pomiędzy źrenicami obserwatora) oraz regulacja dioptrii (dostępna w jednym z okularów) dla wyrównania różnić pomiędzy oczami obserwatora; wreszcie nasadka może mieć wyjście do podłączenia aparatu fotograficznego, kamery cyfrowej, może to być tzw. nasadka trójokularowa lub dedykowana,
stereoskopia - mikroskop z nasadką binokularną to nie to samo co mikroskop stereoskopowy, w mikroskopii stereoskopowej obraz dochodzący do każdego z oczu różni się, obserwator ma wrażenie postrzegania głębi obrazu, w mikroskopie binokularnym jest ten sam; mikroskopy stereoskopowe, ze względów konstrukcyjnych, najczęściej operują na powiększeniach (obiektyw x okular) poniżej 100x,

Okulary: służą do powiększenia (i obserwacji ocznej) obrazu tworzonego przez obiektyw mikroskopu, dodatkowo mogą korygować wady obrazu z obiektywu,

MIKROSKOP POLARYZACYJNY

Mikroskop opt. przystosowany do badania preparatów (gł. anizotropowych) w świetle spolaryzowanym liniowo. Mikroskop polaryzacyjny jest zaopatrzony dodatkowo w polaryzator, analizator oraz soczewkę Bertranda, której włączenie powoduje, że przez okular obserwuje się nie obraz badanego preparatu, lecz obraz źrenicy wejściowej obiektywu. Jeśli polaryzator jest skrzyżowany z analizatorem, w źrenicy obiektywu jest widoczny czarny krzyż tzw. konoskopowy; wstawienie do mikroskopu polaryzacyjnego preparatu anizotropowego modyfikuje krzyż, a nawet przekształca go w zupełnie inną figurę (zależnie od charakteru anizotropowości). Gdy badanym obiektem jest jedno- lub dwuosiowy kryształ, oprócz krzyża obserwuje się barwne prążki i figury interferencyjne (tzw. obrazy konoskopowe), do których analizy służą zwykle załączone kompensatory dwójłomne lub płytki opóźniające (np. ćwierćfalówka). Pierwszy mikroskop polaryzacyjny zbudował 1834 H.F. Tabolt, a D. Brewster wykorzystał do pierwszych systematycznych badań minerałów. Mikroskopy polaryzacyjne są stosowane m.in. w metalografii, przemyśle szklarskim, przemyśle włók., biologii (do badania struktury komórek i tkanek).

MIKROSKOP ELEKTRONOWY SKANINGOWY

(ang. Scanning Elektron Microscope (SEM)) Rodzaj mikroskopu elektronowego, w którym wiązka elektronów, skupiona na powierzchni badanej próbki w plamkę o b. małej średnicy (do 0,1 nm), omiata wybrany prostokątny obszar powierzchni ruchem skanującym, linia po linii. Wiązka elektronów, wytworzona w dziale elektronowym, jest przyspieszana w polu elektr. o potencjale 0,1 30 kV i skupiana przez soczewki elektromagnet.; cewki odchylające nadają jej ruch skanujący. Elektrony wiązki, wnikające w próbkę na niewielką głębokość, częściowo z powrotem z niej wychodzą, ulegając tzw. wstecznemu rozproszeniu; większość z nich jednak pozostaje w próbce, tracąc energię w różnego rodzaju oddziaływaniach, czemu towarzyszy emisja elektronów wtórnych, elektronów Augera, promieni rentgenowskich, światła i in. Różnego rodzaju promieniowanie (po zastosowaniu odpowiedniego detektora) można wykorzystać do tworzenia obrazu próbki oglądanego na ekranie monitora (najczęściej wykorzystuje się emisję elektronów wtórnych, których powstaje najwięcej). Na przykład emitowane przez próbkę elektrony wtórne lub wstecznie rozproszone zostają wychwycone przez detektor, a sygnał wychodzący z detektora, po wzmocnieniu, steruje jasnością wiązki elektronów poruszającej się po ekranie monitora obrazowego synchronicznie z ruchem wiązki skanującej próbkę; obraz jest zatem tworzony czysto elektronicznie, bez udziału soczewek, i jest pewnego rodzaju mapą intensywności emisji elektronów wtórnych lub rozproszonych; różnice w ilości emitowanych elektronów, związane z lokalnymi różnicami kąta padania na nierówności powierzchni albo ze zróżnicowanym składem chem., powodują powstanie kontrastów w obrazie. Zwykle używa się różnych detektorów dla elektronów wtórnych (o małej energii) i dla elektronów wstecznie rozproszonych (o energii zbliżonej do energii elektronów bombardujących próbkę). Zastosowanie do tworzenia obrazu detektora promieniowania rentgenowskiego, sprzężonego z analizatorem energii tego promieniowania (np. spektrometrem rentgenowskim) umożliwia dokonywanie analiz chem. wybranych obszarów, a nawet uzyskanie mapy składu chem. powierzchni próbki.

Powiększenie SEM jest prostym stosunkiem wielkości ekranu monitora obrazowego do wielkości skanowanego obszaru i można go zmieniać w szerokich granicach. Rozdzielczość najlepszych SEM sięga obecnie (1999) 1 nm, a powiększenia dochodzą do kilkuset tysięcy razy. SEM odznaczają się b. dużą głębią ostrości, dzięki czemu stosuje się je do badania preparatów o nierównej powierzchni (przełomów materiałów konstrukcyjnych, całych mikroorganizmów, papieru, tkanin). W ostatnim trzydziestoleciu SEM znalazł zastosowanie we wszystkich prawie dziedzinach nauki i techniki, wszędzie tam, gdzie są potrzebne informacje o morfologii powierzchni i składzie chem. w mikroobszarach. Pomysłodawcą zbudowania SEM był 1938 niem. fizyk M. von Ardenne; jednak został skonstruowany dopiero w poł. lat 60., ponieważ wymagało to użycia zaawansowanych elementów elektronicznych.

Skaningowy mikroskop sił atomowych (skonstruowany po raz pierwszy w laboratoriach firmy IBM) jest połączeniem bardzo prostej idei z zaawansowanymi rozwiązaniami technicznymi, dostępnymi dopiero w obecnych latach. Konstrukcja przyrządu bardzo przypomina ideę gramofonu starego typu. Po powierzchni badanej próbki (lub nad nią) przesuwa się delikatne ostrze umieszczone na końcu małej, płaskiej sprężynki. Pod działaniem siły pomiędzy atomami ostrza i atomami próbki sprężynka ulega ugięciu, zgodnie z prostym równaniem F = k. x, gdzie F jest wartością działającej siły, x wychyleniem, a k stałą opisującą sprężynkę (stałą sprężystości). Zasada działania oparta jest na pomiarze tej siły. Ponieważ aktualne metody pozwalają na pomiar wychylenia x z precyzją wielokrotnie wyższą, niż średnica atomu, dokładność pomiaru siły jest tak duża, że możliwe jest odwzorowanie szczegółów o wielkości porównywalnej z rozmiarami atomu. Można uzyskać mikroskopowe mapy, opisujące zarówno ukształtowanie powierzchni, jak też jej własności jak tarcie, adhezja, rozkład ładunku elektrostatycznego, czy struktura domen magnetycznych. Przeprowadzenie pomiaru zwykle nie wymaga skomplikowanych procedur dla przygotowania badanej próbki i może być dokonane zarówno w powietrzu, jak w cieczy, czy w próżni. Otwiera to nowe, dotychczas nieosiągalne możliwości - tak np. w biologii staje się możliwe obrazowanie i badanie własności żywych komórek w ich naturalnym, ciekłym środowisku, co jest utrudnione w przypadku szeroko dotychczas stosowanej mikroskopii elektronowej. Aby pomiary mogły być przeprowadzane w naturalnym środowisku biologicznym, mikroskop został wzbogacony o specjalną przystawkę, tzw. komorę cieczową. Mikroskop zbudowany w IFJ jest aktualnie wykorzystywany w dwóch obszarach badań. Pierwszy z nich to badanie własności powierzchni materiałów tj. ukształtowania, szorstkości oraz współczynnika tarcia. Drugi obszar obejmuje badania materiału biologicznego, przede wszystkim własności mechanicznych żywych komórek - adhezji oraz elastyczności (modułu Younga), mających ogromne znaczenie dla poznania procesów biologicznych w skali komórki i subkomórkowej, w tym również dla medycyny.

Mikroskopijny mikroskop

Schemat urządzenia.
Każdy ze skanerów operuje w innym wymiarze
Naukowcy z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley budują mikroskopijny mikroskop. W przyszłości, dzięki podobnym urządzeniom doktorzy obserwować będą mogli np. wnętrze komórki guza, kiedy wdziera się do niej lek na raka.

Profesor Luke P. Lee i doktoryzujący się u niego Sunghoon Kwon zajrzeli do wnętrza komórki rośliny przez soczewki nie większe niż kropka na końcu tego zdania. Skaner i mikrosoczewki stworzone przez prof. Lee są 500 do 1000 razy mniejsze niż zwyczajne urządzenia podobnej klasy. Testy wykazały, że zdjęcia wykonane przez miniaturowe urządzenie są takie same, jak te zrobione przez duże maszyny. Testowano zdjęcia dwuwymiarowe.

W przygotowaniu są obrazy trójwymiarowe. Maleńki mikroskop wprowadzić będzie można do wnętrza organizmu, aby np. na żywo obserwować proces leczenia. Urządzenie prof. Lee będzie nie tylko mniejsze, ale również dużo tańsze niż duże mikroskopy tej samej klasy, które kosztują około miliona dolarów.