Nauki Marcina Lutra dotarły do Polski dość wcześnie, szczególnie zaś do zamieszkanych przez Niemców miast. Panujący wówczas w Rzeczpospolitej Zygmunt Stary odnosił się on do idei reformacyjnej niechętnie. W 1520 r. wydał on pierwszy z licznych zakazów przyjmowania nowej wiary, które jednak nie były egzekwowane. Jego następca Zygmunt August nie sprzeciwiał się natomiast szerzeniu się reformacji. Na jego stanowisko wpłynęła rosnąca popularność wyznań reformowanych wśród szlachty oraz liczna obecność różnowierców w izbie poselskiej i senacie. Prawną gwarancję tolerancji religijnej stanowiła zawarta w 1573 r. konfederacja warszawska, której postanowienia włączone zostały do artykułów henrykowskich.
W XVI w. głównymi kierunkami reformacji na ziemiach polskich były luteranizm oraz kalwinizm. Pierwszy z nich przyjęty został we Wrocławiu już w 1521 r., a w 1525 r. W Gdańsku. W pozostałych miastach współistniał z innymi wyznaniami, przy czym szczególnie popularny był w Prusach Królewskich. Kalwinizm od połowy XVI w. zdobył sobie natomiast popularność wśród szlachty. Silne jego ośrodki istniały zwłaszcza w Małopolsce i na Litwie. Do Rzeczpospolitej w pierwszej połowie XVI w. przybywali także Bracia Czescy (osiedlając się głównie Wielkopolski), którzy uciekali przed prześladowaniami grożącymi im w Czechach.
W 1562 r. nastąpił wśród kalwinistów podział na zbór większy (czyli właściwych kalwinów) i zbór mniejszy (czyli arian-antytrynitarzy, zwanych też Braćmi Polskimi). Arianie nie brali udziału w wojnach, odmawiali też występowania przed sądami i nie obejmowali urzędów. Mimo to niektórzy z nich byli aktywnymi uczestnikami życia politycznego. Najgłośniejszym ośrodkiem ariańskim w Rzeczpospolitej był Raków, gdzie mieściło się gimnazjum (zamknięte w 1638). W 1658 r. arianie zostali wygnanie z Rzeczpospolitej ze względu na sprzyjanie Szwedom w czasie potopu. Z racji kwestionowania dogmatu Trójcy Św. arianie byli ostro krytykowani przez wszystkie wyznania chrześcijańskie.
W 1570 r. zawarta została tzw. zgoda sandomierska pomiędzy wyznaniami reformowanymi w Rzeczpospolitej (bez arian). Jej celem było zaprzestanie walk między różnymi odłamami protestantyzmu i przygotowanie gruntu pod ich zjednoczenie.