Hybrydyzacja northern (ang. northern blot) – stosowana w biologii molekularnej metoda służąca do detekcji określonych sekwencji nukleotydów w RNA. Najczęściej stosuje się ją do wykrywania mRNA pochodzących z genów ulegających transkrypcji w komórce. Technika została opracowana przez Jamesa Alwine’a, Davida Kempa i George’a Starka z Uniwersytetu Stanforda w 1977 roku[1]. Nazwa metody jest grą angielskich słów z nazwą wcześniejszej metody wykrywania sekwencji DNA, zwanej (od nazwiska twórcy, Edwina Southerna) hybrydyzacją Southerna (ang. southern – południowy; northern – północny).

Metodyka

Schemat procedury metody northern

Procedura rozpoczyna się od izolacji RNA z materiału biologicznego (może to być np. zhomogenizowana tkanka, kultura komórkowa, izolowane organelle). Zależnie od eksperymentu można użyć całkowitego RNA lub oczyszczonej frakcji poli(A), która zawiera jedynie poliadenylowane RNA. W drugim podejściu próbka jest wzbogacona w cząsteczki mRNA w porównaniu z całkowitym RNA (gdzie ilościowo przeważają cząsteczki rRNA i tRNA), co pozwala na badanie genów o niskim poziomie ekspresji. Oczyszczanie frakcji poli(A) można przeprowadzić np. z użyciem celulozy z trwale związanym kwasem oligotymidynowym – oligo(dT)[2].

Wyizolowany RNA poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu w warunkach denaturujących. Stosowane czynniki denaturujące to np. mieszanina glioksalu z DMSO[3][4], formaldehyd[5], formamid lub mocznik[6]. Współcześnie najszerzej stosowane są żele agarozowe z dodatkiem formaldehydu albo poliakrylamidowe z dodatkiem mocznika. Te ostatnie pozwalają na rozdzielenie mniejszych cząsteczek RNA, stąd są używane przy detekcji tzw. małych RNA (ang. small RNAs np. siRNA, miRNA)[7].

Kolejnym etapem jest transfer RNA na membranę. W zależności od użytej metody rozdziału stosuje się transfer kapilarny (do żeli agarozowych) albo transfer w polu elektrycznym (do żeli poliakrylamidowych). Transfer kapilarny prowadzi się podobnie jak w metodzie Southerna – żel układa się na arkusz papieru filtracyjnego zanurzony w rezerwuarze roztworu do transferu, na żel kładzie się membranę (nitrocelulozową[3] lub nylonową[8]), którą pokrywa się kilkoma arkuszami papieru filtracyjnego i stosem suchych, papierowych ręczników. Na koniec całą konstrukcję przyciska się równomiernie ok. półkilogramowym obciążnikiem. Transfer prowadzi się zwykle kilkanaście godzin (12-16 h). Za transport odpowiadają siły kapilarne. Roztwór migruje pionowo od naczynia przez żel i membranę do papierowych ręczników, a wraz z nim wędrują cząsteczki RNA. Transfer w polu elektrycznym (analogiczny do stosowanego w metodzie western) stosuje się w przypadku żeli poliakrylamidowych. Przepływ prądu powoduje przeniesienie ujemnie naładowanych cząsteczek RNA z żelu na membranę.

RNA ulega adsorpcji na membranie dzięki oddziaływaniom hydrofobowym. Utrwalenie kwasów nukleinowych na membranie (po zakończeniu transferu) osiąga się przez wypiekanie w wysokiej temperaturze (dla membran nitrocelulozowych) lub naświetlanie lampą UV[9] (dla membran nylonowych), co prowadzi do utworzenia wiązań kowalencyjnych między cząsteczkami kwasu nukleinowego a grupami funkcyjnymi na powierzchni membrany. Proces utrwalania jest znany w żargonie pod angielską nazwą cross-linking.

Ocena jakości RNA na membranie i efektywności transferu jest możliwa dzięki barwieniu roztworem błękitu metylenowego[10].

Tak przygotowaną membranę umieszcza się w roztworze prehybrydyzacyjnym (blokowanie membrany), a następnie hybrydyzacyjnym – zawierającym sondę hybrydyzacyjną. Może nią być odcinek DNA lub RNA o sekwencji komplementarnej do wykrywanego fragmentu RNA. Sondę należy wcześniej wyznakować, by możliwa była jej detekcja. Najpopularniejsze są sondy znakowane radioaktywnie (izotopem 35P), używa się również sond znakowanych biotyną lub digoksygeniną[11]. Po etapie hybrydyzacji membranę płucze się w celu usunięcia nadmiaru niezwiązanej sondy. Detekcję radioaktywnych sond prowadzi się z użyciem klisz fotograficznych. Sondy nieradioaktywne wykrywa się za pomocą streptawidyny (o bardzo silnym powinowactwie do biotyny) lub przeciwciał przeciwko digoksygeninie skoniugowanych z fluoroforem lub peroksydazą chrzanową (detekcja analogiczna do metody western)[12].

Zastosowania metody

Głównym zastosowaniem metody northern jest analiza ekspresji genów na poziomie RNA. Przez odpowiednie zaprojektowanie sondy można uzyskać informacje o m.in. wielkości danego transkryptu i jego prekursorów[13], produktach pośrednich splicingu[14], czy jego względnej ilości w komórce. Dzięki temu można porównać profil ekspresji wybranych genów w poszczególnych tkankach[15][16], na różnych etapach rozwoju[16] lub zmiany ekspresji pod wpływem różnych czynników (na przykład stresu środowiskowego[17], leków[18], zakażenia patogenem).

Przypisy

  1. ↑ publikacja w otwartym dostępie – możesz ją przeczytać J C Alwine, D J Kemp, G R Stark, Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes, „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 74 (12), 1977, s. 5350–5354, PMID: 414220, PMCID: PMC431715.
  2. ↑ publikacja w otwartym dostępie – możesz ją przeczytać Haim Aviv, Philip Leder, Purification of Biologically Active Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic acid-Cellulose, „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 69 (6), 1972, s. 1408–1412, PMID: 4504350, PMCID: PMC426713.
  3. 1 2 P S Thomas, Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose, „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 77 (9), 1980, s. 5201–5205, PMID: 6159641, PMCID: PMC350025.
  4. ↑ publikacja w otwartym dostępie – możesz ją przeczytać G K McMaster, G G Carmichael, Analysis of single- and double-stranded nucleic acids on polyacrylamide and agarose gels by using glyoxal and acridine orange, „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 11, 1977, s. 4835–4838, PMID: 73185, PMCID: PMC432050.
  5. ↑ publikacja w otwartym dostępie – możesz ją przeczytać N Rave, R Crkvenjakov, H Boedtker, Identification of procollagen mRNAs transferred to diazobenzyloxymethyl paper from formaldehyde agarose gels, „Nucleic Acids Research”, 6 (11), 1979, s. 3559–3567, DOI: 10.1093/nar/6.11.3559, PMID: 573889, PMCID: PMC327956.
  6. ↑ publikacja w otwartym dostępie – możesz ją przeczytać Heike Summer, René Grämer, Peter Dröge, Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE), „Journal of Visualized Experiments”, 2009 (32), 2009, DOI: 10.3791/1485, PMID: 19865070, PMCID: PMC3329804.
  7. ↑ publikacja w otwartym dostępie – możesz ją przeczytać Donald C. Rio, Northern Blots for Small RNAs and MicroRNAs, „Cold Spring Harbor Protocols”, 2014 (7), 2014, s. 793–797, DOI: 10.1101/pdb.prot080838, PMID: 24987143 (ang.).
  8. ↑ publikacja w otwartym dostępie – możesz ją przeczytać K C Reed, D A Mann, Rapid transfer of DNA from agarose gels to nylon membranes, „Nucleic Acids Research”, 13 (20), 1985, s. 7207–7221, PMID: 4059056, PMCID: PMC322039.
  9. ↑ E.W. Khandjian, Optimized Hybridization of DNA Blotted and Fixed to Nitrocellulose and Nylon Membranes, „Nature Biotechnology”, 5 (2), 1987, s. 165–167, DOI: 10.1038/nbt0287-165.
  10. ↑ D.L. Herrin, G.W. Schmidt, Rapid, reversible staining of northern blots prior to hybridization, „BioTechniques”, 6 (3), 1988, s. 196–200, PMID: 2483319.
  11. ↑ publikacja w otwartym dostępie – możesz ją przeczytać M Farquharson, R Harvie, A M McNicol, Detection of messenger RNA using a digoxigenin end labelled oligodeoxynucleotide probe, „Journal of Clinical Pathology”, 43 (5), 1990, s. 424–428, PMID: 2370311, PMCID: PMC502456.
  12. ↑ M.I. Shifman, D.G. Stein, A reliable and sensitive method for non-radioactive northern blot analysis of nerve growth factor mRNA from brain tissues, „Journal of Neuroscience Methods”, 59 (2), 1995, s. 205–208, DOI: 10.1016/0165-0270(94)00184-I, PMID: 8531488.
  13. ↑ publikacja w otwartym dostępie – możesz ją przeczytać Edyta Koscianska i inni, Northern blotting analysis of microRNAs, their precursors and RNA interference triggers, „BMC Molecular Biology”, 12 (art. nr 14), 2011, DOI: 10.1186/1471-2199-12-14, PMID: 21481235, PMCID: PMC3080303.
  14. ↑ publikacja w otwartym dostępie – możesz ją przeczytać Kapil Vashisht i inni, Splice Junction Map of Simian Parvovirus Transcripts, „Journal of Virology”, 78 (20), 2004, s. 10911–10919, DOI: 10.1128/JVI.78.20.10911-10919.2004, PMID: 15452211, PMCID: PMC521819 (ang.).
  15. ↑ publikacja w otwartym dostępie – możesz ją przeczytać Shiping Liu i inni, MicroRNAs show diverse and dynamic expression patterns in multiple tissues of Bombyx mori, „BMC Genomics”, 11 (art. nr 85), 2010, DOI: 10.1186/1471-2164-11-85, PMID: 20122259, PMCID: PMC2835664.
  16. 1 2 Wigard P. Kloosterman i inni, Cloning and expression of new microRNAs from zebrafish, „Nucleic Acids Research”, 34 (9), 2006, s. 2558–2569, DOI: 10.1093/nar/gkl278, PMID: 16698962, PMCID: PMC3303176 (ang.).
  17. ↑ publikacja w otwartym dostępie – możesz ją przeczytać Amit A Deokar i inni, Comparative analysis of expressed sequence tags (ESTs) between drought-tolerant and -susceptible genotypes of chickpea under terminal drought stress, „BMC Plant Biology”, 11 (art. nr 70), 2011, DOI: 10.1186/1471-2229-11-70, PMID: 21513527, PMCID: PMC3110109.
  18. ↑ publikacja w otwartym dostępie – możesz ją przeczytać Rashmi Narendrula i inni, RNA disruption is associated with response to multiple classes of chemotherapy drugs in tumor cell lines, „BMC Cancer”, 16 (art. nr 146), 2016, DOI: 10.1186/s12885-016-2197-1, PMID: 26911141, PMCID: PMC4765116.

Bibliografia

  • Chapter 7. Extraction, Purification, and Analysis of mRNA from Eukaryotic Cells. W: Josep Sambrook, David W. Russell: Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbour, 2001. ISBN 0-87969-577-3.
This article is issued from Wikipedia. The text is licensed under Creative Commons - Attribution - Sharealike. Additional terms may apply for the media files.