Kolumna wypełniona złożem agarozowym z niklem, stosowana do oczyszczania białek zawierających znacznik histydynowy

Chromatografia powinowactwa – rodzaj chromatografii adsorpcyjnej, w której wykorzystuje się wzajemne swoiste powinowactwo dwóch substancji, zdolnych do tworzenia kompleksów ligand–substrat, np.[1]:

W przypadku każdej pary cząsteczek nie ma znaczenia, która z nich zostanie wybrana jako ligand i immobilizowana[1].

Zasada działania

Fazę stacjonarną stanowi obojętny chemicznie, nierozpuszczalny polimer (np. żel dekstranowy, agarozowy lub poliakrylamidowy) związany z ligandem. Umieszcza się go w kolumnie, a następnie równoważy odpowiednim buforem myjącym. Kolejnym krokiem jest przepuszczenie roztworzonego substratu (fazy ruchomej) przez złoże. Podczas rozdziału chromatograficznego z fazą stacjonarną wiążą się tylko te cząsteczki analizowanej mieszaniny, które wykazują do nich swoiste powinowactwo. Następnie przemywa się kolumnę buforem myjącym, by wypłukać nieswoiście związane białka i inne składniki fazy ruchomej. Składniki związane przez nośnik mogą być z niego wymyte przez zmianę pH, zwiększenie siły jonowej lub wprowadzenie do fazy ruchomej czynnika rozrywającego powstałe połączenia - stosuje się do tego bufor elucyjny[1].

Zalety i wady

Chromatografia powinowactwa jest selektywna – pozwala na wyizolowanie z mieszaniny substancji zbliżonych pod względem budowy chemicznej pojedynczego składnika o wysokiej czystości i w dużym stężeniu. Charakteryzuje ją również duża uniwersalność – dzięki niej można rozdzielać bardzo różne substancje (od węglowodorów niepolarnych i słabo polarnych do zasad organicznych i kwasów silnie polarnych). Metoda ta jest również bardzo czuła, zwłaszcza dla substancji znakowanych izotopowo. W praktyce jednak chromatografia powinowactwa jest wykorzystywana w szczególnych przypadkach, gdyż wymaga długich i dokładnych przygotowań (składniki adsorbatu nie mogą reagować ze sobą, solwentem i adsorbentem; nie mogą również być adsorbowane nieodwracalnie). Często jest również techniką dość kosztowną[1][2].

Przypisy

  1. 1 2 3 4 Chromatografia powinowactwa, [w:] Leokadia Kłyszejko-Stefanowicz (red.), Ćwiczenia z biochemii, Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 1999, s. 147–166, ISBN 83-01-12952-2.
  2. ↑ Maria Rąpała-Kozik, Chromatografia powinowactwa i techniki pośrednie, [w:] Adam Dubin (red.), Wprowadzenie do chemii białek, Wydział Biotechnologii UJ, Kraków 2003 [dostęp 2023-05-27].
This article is issued from Wikipedia. The text is licensed under Creative Commons - Attribution - Sharealike. Additional terms may apply for the media files.